Tcnicas de DNA

recombinante.

Fichero virtual
Alumno: Daniel Efran Hernndez
Gutirrez
Docente: M.C. Patricia Islas Salinas
Materia: Biologa Molecular
Matrcula: 136689
Programa: Mdico Cirujano

Tcnicas de DNA
recombinante.
A partir de los aos 70 se desarrollaron las herramientas de la biologa molecular o la
ingeniera gentica o lo que se ha llamado tcnicas del ADN recombinante. En estas
primeras etapas se estaba trabajando sobre la posibilidad de manipular los genes, es decir:
A) Tenerlos aislados.
B) Amplificarlos, en el sentido de tener muchas copias de la misma secuencia.
C) Conocer la secuencia exacta, es decir el orden de las bases de esos genes.
D) Una vez aislado poderlo expresar fuera de su localizacin natural.

 La tcnica del ADN recombinante se usa en estudios de la regulacin de la

expresin gnica, en la regulacin de sntesis de protenas y produccin en gran
escala como la Insulina, en el desarrollo de organismos transgnicos y en la
amplificacin del ADN. Una tcnica importante y de las ms principales es la de
PCR, reaccin de cadena de la polimerasa, la cual es rpida y parte las trenzas
de ADN y aprovecha la replicacin. (10) (11) (13)

Manejo de muestras biolgicas

para el diagnstico molecular.

Manejo de muestras biolgicas para el

diagnstico molecular.

Las denominadas tcnicas moleculares de diagnstico se estn incorporando al espectro de

herramientas propias de la microbiologa clnica, como una opcin que salva las dificultades
de deteccin de microorganismos no cultivables o de difcil/lento desarrollo in vitro y con la
ventaja frente a las tcnicas basadas en el cultivo. Se debe seleccionar el tipo de banco, los
criterios de seleccin y el almacenamiento, se debe evitar una contaminacin cruzada y lleva
la etapa pre-analtica, analtica y post-analtica. (3) (9) (15)

Normas para el manejo.

NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos
biolgico-infecciosos - Clasificacin y especificaciones de manejo. Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice:
Estados Unidos Mexicanos.- Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales.
IML-0011: Para la recoleccin de evidencias tanto biolgicas como de materiales en general que sern objeto de pericia se
debern usar:
Recipientes
Jeringas
Etiquetado y almacenamiento
Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos (RPBI): Para que un residuo sea RPBI debe tener agentes biolgicoinfecciosos. La norma seala como agente biolgico-infeccioso cualquier organismo que sea capaz de producir enfermedad.
(7) (8) (12)

Instrumental y equipos bsicos para

extraccin y manejo.
El puesto de trabajo debe de estar limpio y ordenado. El material necesario debe prepararse antes de
empezar a trabajar y colocarse de forma adecuada para que se facilite su utilizacin as se evitarn
accidentes y se minimizar el riesgo de contaminacin.

Mesas de laboratorio y fregadero

Para poner los materiales y el

equipo que se va a utilizar durante
una prctica.

Vitrinas y armarios

Para

guardar

diversos productos
y material.

Mechero Bunsen

Para calentar y esterilizar

muestras.

Estufa de incubacin

Gradillas

Para sostener los

tubos de ensayo.

Es

una

cmara

controlada

para

microorganismos.
facilitar

de

el

Se

temperatura
cultivo

de

utiliza

para

desarrollo

de

los

microorganismos a su temperatura
ptima de crecimiento.

Frigorfico o cmaras refrigeradas.

Se utilizan para conservar tanto

materiales como microorganismos.

Congeladores

Se utilizan para la conservacin de reactivos y microorganismos

a temperaturas inferiores a 0C, llegando a -80C

Microscopio ptico
Para mirar objetos pequeos.

Centrfuga

Aparato que permite la separacin de

los distintos componentes.

Desionizador de agua

Para el intercambio inico.

Contador de colonias

Es

un

aparato

que

mediante

la

iluminacin de la placa y una lupa, nos

permite observar con mayor nitidez.

Cmaras de seguridad biolgica.

Proporcionan una barrera de proteccin.

Baos termostticos

Balanzas:
Para pesar
muestras.

Son recipientes que contienen agua y

un

sistema

temperatura.

de
Se

regulacin

de

utilizan

la

para

atemperar medios de cultivo o incluso

para

incubar

cultivos

de

microorganismos.
Jarras de anaerobios

Asas de siembra

Recipientes que se usan

para

conseguir

una

atmsfera libre de oxgeno.

pH-Metros
Para medir el Ph de
las sustancias.

Se utilizan para sembrar. Pueden

ser metlicas o de plstico.

Material fungible
Placas de Petri
Recipientes para la preparacin de
medios de cultivo slidos.

Pipetas de vidrio
Para
Tubos con medio lquido
Tubos con medio slido
Ambos sirven para identificar
bacterias.

dar

volmenes

exactos.

Asas acodadas

Se utilizan para la extensin de

microorganismos

sobre

la

superficie de un medio de cultivo

Pipetas automticas

en placa Petri.

Se utilizan para pipetear pequeas

cantidades de lquidos.

Portas y cubres
Para realizar las observaciones
al microscopio.

Cucharas y esptulas

Vasos de precipitado

Se utilizan para pesar muestras o medios

de cultivo.

Poner algn material o

sustancia.

Autoclave
Para esterilizar con cinta
testigo.

Horno de Pasteur
Acta principalmente desnaturalizando las protenas
y

secundariamente

oxidando

los

compuestos

celulares.

(1) (2)
(5)

Normas de bioseguridad.
La Bioseguridad son el conjunto de normas y procedimientos que garantizan el control
de los factores de riesgo, la prevencin de impactos nocivos y el respeto de los lmites
permisibles, sin atentar contra la salud de las personas que laboran y garantiza que el
producto de los mismos no atente contra la salud de la comunidad en general, ni contra
el ambiente. Las normas de bioseguridad estn destinadas a reducir el riesgo de
transmisin de microorganismos de fuentes reconocidas o no reconocidas de infeccin
en Servicios de Salud.

 Se debe tomar en cuanta lavarse las manos, no tener el cabello suelto,

lavarse las manos, usar guates, no fumar, proteccin ocular, tapabocas,
proteccin corporal, material desechable, material de curaciones y
limpieza diaria.
Llevan a cabo el Manual de organismos vivos e infecciosos
Manejo de qumicos, drogas y hormonas
Proteccin ambiental (4) (6) (14) (16)

Tcnicas de DNA recombinante.

Fichero virtual parte 2
Alumno: Daniel Efran Hernndez
Gutirrez
Docente: M.C. Patricia Islas Salinas
Materia: Biologa Molecular
Matrcula: 136689
Programa: Mdico Cirujano

Extraccin de cidos nucleicos

a) Concepto de extraccin de ADN

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayora de los estudios de biologa
molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten
obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de
modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los
cidos nucleicos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos
nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin
adecuados. Los contaminantes capaces de inhibir el anlisis PCR se enumeran. Con objeto de evitar los falsos
negativos debidos a la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, se recomienda vivamente efectuar un
experimento de control de la inhibicin de la PCR, que suele hacerse mediante PCR especfica de vegetales
(eucariotas o cloroplastos) o de la especie. (17)

b) Etapas de extraccin.
Lisis de la membrana celular:
Tal como se ha mencionado anteriormente, la primera etapa de la extraccin del ADN es la rotura de la membrana
celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampn de extraccin, que contiene
EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biolgicas presentan la misma estructura general, integrada por
molculas de lpidos y de protenas, unidas por interacciones no covalentes.

b) Etapas de extraccin.
las molculas lipdicas estn ordenadas en una doble capa continua, en la que las molculas protenicas estn
disueltas. Las molculas lipdicas estn formadas por extremos hidrfilos, denominados cabezas, y extremos
hidrfobos, denominados colas. En este mtodo, el detergente (CTAB) contenido en el tampn de extraccin
provoca la lisis de la membrana. Dado que la composicin de los lpidos y del detergente es similar, el componente de
CTAB del tampn de extraccin captura los lpidos que integran la membrana celular y nuclear. (17)

b) Etapas de extraccin.
Se libera el ADN genmico cuando el detergente captura los lpidos y las protenas al entrar en contacto la membrana
celular y el tampn de extraccin con CTAB. Con una concentracin salina (NaCl) determinada, el detergente forma
un complejo insoluble con los cidos nucleicos. El EDTA es un componente quelante, que se une al magnesio, entre
otros metales. El magnesio es un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la
desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solucin la capacidad de amortiguar el pH (un pH
inferior o superior daa el ADN). Es importante sealar que, como los cidos nucleicos se degradan fcilmente en esta
fase de la purificacin, debe reducirse al mnimo el tiempo transcurrido entre la homogeneizacin de la muestra y la
adicin de la solucin tampn con CTAB. Una vez que se han roto las membranas de la clula y de los orgnulos
(como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el ADN. (17)

b) Etapas de extraccin.
Extraccin:

En esta etapa, se separan los complejos formados por los cidos nucleicos y el CTAB de los polisacridos, los compuestos
fenlicos, las protenas y los dems lisados celulares disueltos en la solucin acuosa. Es especialmente importante eliminar
los polisacridos y los compuestos fenlicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones enzimticas. En concentraciones
hipo salinas, los contaminantes de los complejos de cidos nucleicos no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la solucin
acuosa con cloroformo. El cloroformo desnaturaliza las protenas y facilita la separacin de las fases acuosa y orgnica. La
fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es densa debido a la concentracin salina, formar la
fase inferior. Adems, si el pH de la solucin acuosa no se ha equilibrado debidamente, los cidos nucleicos tendern a
repartirse en la fase orgnica. Si es preciso, la extraccin con cloroformo se realizar dos o tres veces, con objeto de eliminar
por completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extraccin de los cidos nucleicos, puede retro extraerse
la fase orgnica con una solucin acuosa, que se aade a continuacin al extracto anterior. Una vez purificados los complejos
de cidos nucleicos, puede procederse a la precipitacin, ltima etapa del procedimiento.
(17)

b) Etapas de extraccin.
Precipitacin:
En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del detergente, para lo cual la solucin acuosa
se trata primero con una solucin de precipitacin compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en
concentracin elevada. Una alta concentracin salina es necesaria para que se forme un precipitado
de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su capacidad
tampn. En estas condiciones, el detergente, que es ms soluble en alcohol que en agua, puede
eliminarse por lavado, mientras que los cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol
al 70 % permite una mayor purificacin o elucin de los cidos nucleicos de la sal residual.(17)

c) Bases o fundamentos para la

extraccin.
La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atrados hacia las
cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar (romper)
las clulas mediante un detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn en la que se
disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN,
carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud,
se habrn fraccionado en cadenas ms pequeas y separado de l por accin del detergente. Slo queda, por tanto,
extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, para lo cual se utiliza alcohol etlico al 95%. (17)

d) Mtodos para la extraccin

Mtodo o protocolo Tradicional:
Separacin de protenas y lpidos
En esta etapa se separa el ADN de las protenas y lpidos mediante solventes orgnicos y ciclos de centrifugacin. Se
utiliza la fuerte tendencia hidroflica de los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos, mientra que las
protenas y los lpidos se separan en solventes orgnicos. La fase acuosa y la orgnica se separan por centrifugacin
lo quepermite aislar al ADN. Los solventes que se usan frecuentemente son el fenol,el cloroformo y el alcohol
isoamlico. Estos reactivos contaminan fcilmente el ADN, por lo que se debe evitar acarrearlos en el proceso de
purificacin. (19)

d) Mtodos para la extraccin

Precipitacin del ADN
Despus de que son eliminados los lpidos y las protenas, se recupera el ADN. Para ello, se adiciona
etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen a los grupos
fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue
sobre s mismo hacindolo insoluble. Un paso de centrifugacin permite que el ADN permanezca en el
fondo del tubo mientras que el etanol es desechado. restos de etanol se eliminan con un lavado con
etanol al 70% y el remanente se elimina por evaporacin. (19)

d) Mtodos para la extraccin

Redisolucin del ADN
Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para mantenerlo en
solucin. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para permitir la redisolucin completa del
ADN y evitar una hidrlisis acida. Cuando se utiliza una solucin amortiguadora, es preferible utilizar
una solucin de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0 para almacenar el material. Cuando
se est disolviendo el ADN es importante evitar el pipeteo y la agitacin agresiva pues se pueden
fragmentar molculas de alto peso molecular. Una opcin que evita la fragmentacin consiste en
incubar a 55 C el ADN, 1 a 2 horas con agitacin suave.(19)

d) Mtodos para la extraccin

Mtodo o protocolo Comercial:
Unin del ADN a la matriz inorgnica y lavado:
En el caso del kit con membrana de slice, en algunos casos a la mezcla de lisis se le aade la solucin de unin que
tiene un pH especfico. Antes de pasar la solucin de lisis a travs de la columna, se adiciona etanol a la solucin,
eliminando la capa hidratante del ADN y exponiendo sus grupos fosfato, facilitando con ello la adsorcin de la molcula
a la membrana cargada positivamente. Los lpidos y protenas no son afines a la membrana y se eliminan con ayuda de
la solucin de lavado y un ciclo de centrifugacin, mientras que el material gentico permanece unido a la matriz.
El kit con perlas magnticas adems de utilizar soluciones a pH especficos, utiliza un imn o magneto que atrae a las
perlas para separarlas de las soluciones en las que se encuentran suspendidas. En este caso, se aade a la solucin
de lisis una solucin amortiguadora a pH cido que permite cargar positivamente a las perlas, favoreciendo la unin de
ADN. Las protenas y lpidos tienen baja afinidad por las perlas y son eliminados con soluciones de lavado a pH
fisiolgico. Las perlas son retenidas en la pared del micro tubo con el magneto, mientras que la solucin con los
contaminantes se eliminan por pipeteo.
(19)

d) Mtodos para la extraccin

Recuperacin del ADN de la matriz:

En los kits es necesario liberar al ADN de la matriz,. La membrana y el ADN se deshidratan con
soluciones de lavado y ciclos de centrifugacin, despus se recomienda centrifugar nuevamente la
columna para evaporar el etanol y eliminar el exceso de las soluciones. Posteriormente, se adiciona
agua o solucin amortiguadora al centro de la membrana, se espera a que el ADN se hidrate, se
centrifuga para recuperarlo de la matriz y re suspenderlo. En el protocolo de perlas magneticas se
utiliza una solucion basica de Tris-HCl 10 mM a pH 8.5 para neutralizar la carga de las perlas. El ADN
se separa de las perlas y transfiere a otro tubo, mientras que las perlas continan siendo retenidas
por el magneto. (19)

d) Mtodos para la extraccin

ENZIMAS QUE MODIFICAN

ACIDOS NUCLEICOS

Enzimas que modifican cidos nucleicos

Las enzimas de restriccin se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del gnero del
microorganismo de procedencia,y a las dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia
(ejemplo: Sma: Serratia marcescens) . El nmero seala el orden cronolgico de descubrimiento de esa enzima en
esa estirpe. Casi todas las secuencias nucleotdicas reconocidas por las endonucleasas de restriccin poseen un eje
de simetra impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el
nombre de palndromos. La rotura se produce en ambas hebras de ADN siendo esta simtrica respecto al eje binario.
(20)

Enzimas que modifican cidos nucleicos

Endonucleasas de restriccin:
Son enzimas que hidrolizan los cidos nucleicos rompiendo enlaces internucleotdicos del interior de la cadena. Las
endonucleasas de restriccin son enzimas producidas principalmente por bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester
del esqueleto de ADN de doble hebra en secuencias especficas. Las endonucleasas de restriccin de tipo II son las
ms tiles en los mtodos de manipulacin del ADN debido a su especificidad de secuencia absoluta (reconocen una
secuencia concreta del cido nucleico), tanto para la reaccin de unin como para la de ruptura.Algunas, tras la rotura
de la cadena pueden producir extremos cohesivos (esto permitir al fragmento generado unirse a otro fragmento de
distinta procedencia que haya sido generado por la misma endonucleasa de restriccin) o extremos romos. (20)

Enzimas que modifican cidos nucleicos

Polimerasas:
Son enzimas capaces de sintetizar ADN o ARN in vitro. La mayora de estas enzimas requieren un molde y
sintetizan una molcula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: ADN
polimerasa I de E. coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde ARN para convertirlo en
ADN), la ADN polimerasa del bacteriofago T7, ARN polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq polimerasa
(enzima empleada en la reaccin en cadena de la polimerasa o PCR). La mayora de las polimerasas necesitan un
pequeo cebador o primer complementario al ADN molde para iniciar la polimerizacin a partir de ese punto. La
transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que aade nucletidos exclusivamente a los extremos
de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2+. (20)

Enzimas que modifican cidos nucleicos

Ligasas (une extremos de ADN protuberantes o romos),
Fosfatasas (eliminan el fosfato de la regin 5 de los cidos nucleicos,
Quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5 que han dejado las fosfatasas)

Vectores recombinantes:

a) Concepto general

Molcula de ADN circular pequea que no forma parte del cromosoma principal del AND circular
de la bacteria. (21)

Una molcula de ADN que puede estar presente en el citoplasma en forma independiente o
incorporada al cromosoma bacteriano. (22)

b) Concepto de plsmido y su obtencin.

Los plsmidos son fragmentos extra cromosmicos de cidos nucleicos (ADN o ARN) que aparecen en el citoplasma de algunos procariotas. Son de tamao
variable aunque menor que el cromosoma principal. Cada bacteria puede tener uno o varios a la vez. Los plsmidos tienen una conformacin variable que
puede ser lineal, circular o con estructura sper enrollada. El control de la replicacin del plsmido depende del tipo de plsmido, existiendo plsmidos cuya
replicacin est acoplada con la replicacin del cromosoma bacteriano y plsmidos cuya replicacin no est relacionada con la del cromosoma. El tipo de
genes que portan los plsmidos es variado, tratndose generalmente de genes que aportan ventajas adaptativas a la bacteria que los porta: genes de
resistencia a antibiticos, genes de produccin de sustancias txicas para otras bacterias o genes que codifican enzimas tiles para degradar sustancias
qumicas. Los plsmidos se pueden clasificar siguiendo distintos criterios. Uno de estos criterios es el tipo de genes que portan. As se define el grupo de
plsmidos con genes de degradacin de sustancias, el grupo de plsmidos con genes de fertilidad, el que porta genes de virulencia o el grupo que porta
genes de resistencia. Los plsmidos son herramientas muy tiles en ingeniera gentica para la transformacin gnica y la manipulacin gentica de
procariotas y eucariotas. Los plsmidos empleados en ingeniera gentica se llaman vectores. Son muy tiles para sintetizar en grandes cantidades protenas
de inters, como la insulina o los antibiticos, mediante un procedimiento conocido como transformacin. El proceso de transformacin comienza con la
seleccin de un plsmido adecuado, en el que se introducen los genes que se quieren expresar con protocolos especficos que usan enzimas de restriccin y
DNA ligasa. Posteriormente se transforma un tipo de bacteria con el plsmido modificado y se seleccionan las bacterias transformadas que produzcan las
sustancias deseadas. Estas bacterias se cultivan en sistemas de tipo biorreactores para su crecimiento en grandes cantidades. En este proceso se eligen
plsmidos con caractersticas que permitan seleccionar las bacterias transformadas en un medio de cultivo como por ejemplo plsmidos con genes de
resistencia a antibiticos o con genes de enzimas que sinteticen compuestos coloreados. Aunque los plsmidos no pueden sintetizar una envoltura proteica y
se transfieren con dificultad de una clula a otra se ha hipotetizado que podran ser los precursores de los primeros virus.(23)

c) Tipos de plsmidos
Existe una amplia variedad de plsmidos. Los plsmidos bacterianos son de muchos tipos distintos, pero a
grandes rasgos podemos clasificarlos atendiendo a diversos caracteres:
1. Segn que sean autotransmisibles por conjugacin o no:
a) plsmidos conjugativos
b) plsmidos no-conjugativos. Dentro de esta categora se incluyen:
i.

plsmidos no movilizables

I.

plsmidos movilizables por otros que s son conjugativos.

(24)

c) Tipos de plsmidos
2. Segn el tipo de fenotipos que codifican (y dejando aparte a los plsmidos crpticos, de los que se desconoce su funcin
fenotpica):
a) Plsmidos R, que codifican una o ms resistencias a drogas (antibiticos) y/o resistencia a metales pesados.
b) Plsmidos bacteriocinognicos, que codifican alguna bacteriocina y simultneamente confieren inmunidad frente a esa bacteriocina a la
bacteria que lo posee. Dentro de ellos, de los ms estudiados son los plsmidos Col, que producen colicinas (bacteriocinas de E. coli).
c) Plsmidos de virulencia, que codifican funciones relacionadas con la virulencia en muchas bacterias patgenas. Por ejemplo:
i.

Plsmido de la toxina tetnica en Clostridium tetani.

ii.

Plsmido de la toxina del ntrax en Bacillus anthracis.

iii.

Plsmidos que codifican factores de colonizacin (para la invasin de los tejidos de su hospedador).

d) Plsmidos de cepas de Pseudomonas, que confieren rutas metablicas capaces de utilizar como fuentes de carbono y energa sustancias
que otros organismos no pueden catabolizar:
i.

plsmidos OCT (degradacin del octano)

ii.

plsmidos TOL/XYL (degradacin del tolueno y xileno)

iii.

plsmidos NAF (degradacin del naftaleno), etc

(24)

c) Tipos de plsmidos
e) Plsmidos de cepas de Rhizobium responsables de funciones relacionadas con el establecimiento de las simbiosis fijadoras de nitrgeno en los
ndulos radicales de las leguminosas (pSym y otros tipos).
f) Plsmidos Ti y Ri de Agrobacterium, responsables de la produccin de tumores en numerosas plantas dicotiledneas.
g) existen igualmente plsmidos que codifican ms de un tipo de fenotipos: p. ej., plsmidos que suministran resistencia a antibiticos y capacidad de
virulencia.
3. Plsmidos segn el grupo de incompatibilidad. Recordar la definicin de incompatibilidad entre plsmidos que se dio oportunamente, y la base de
este fenmeno: dos plsmidos son incompatibles (no pueden permanecer establemente en la misma clula) porque comparten un mismo sistema
de replicacin y segregacin de las copias. Como se sabe, los plsmidos se pueden clasificar segn su pertenencia a un mismo grupo de
incompatibilidad.
a) As p. ej., el plsmido F pertenece al llamado grupo IncFI.
b) Los plsmidos R1 y R100, de resistencia a antibiticos, pertenecen al grupo IncFII.
) Obsrvese que dos plsmidos conjugativos pertenecientes a grupos de incompatibilidad diferentes pueden poseer regiones tra semejantes, y tipos
de pelos sexuales parecidos. Esto es precisamente lo que ocurre con el F comparado con el R1 o el R100.

(24)

d) Bacterifago Lambda
Se trata de un virus complejo de ADN lineal bicatenario. Los extremos de su material gentico son cohesivos y ello hace que tras la infeccin su genoma se haga circular,
comportndose, en caso de seguir un ciclo liso gnico, como un plsmido y aprovechando las enzimas de la recombinacin de la bacteria para integrarse en el genoma de sta. El
fago no tiene por qu integrarse, y de hecho es ms habitual que se comporte como un virus de ciclo ltico.
En el ciclo lisognico, el virus utiliza las enzimas de la recombinacin (vase intermedio de Hollyday) para insertarse en un punto concreto del genoma de la bacteria. En este
estado, el virus se replica cuando lo hace la bacteria, pasando su genoma a las rplicas de E. coli. Adems, una bacteria que posea ya un fago integrado no puede integrar otro, ya
que el virus se introduce en un lugar concreto del cromosoma bacteriano.
El virus sintetiza a partir de su genoma el represor CI, que inhibe la expresin del resto de sus genes. En condiciones de estrs celular, la bacteria activa el sistema de respuesta
SOS. Una de las enzimas que intervienen en la respuesta, Rec A (que tambin interviene en la recombinacin) acta inhibiendo la actividad del represor CI, lo que desemboca una
respuesta en cascada que hace que el virus integrado pase a la va ltica.
El ciclo ltico es la forma ms habitual de actuacin del virus al infectar la clula, y tambin es la va que sigue al final del ciclo liso gnico. En ella se producen partculas virales que
son liberadas al medio una vez que la bacteria hospedadora es lisada, matando a la bacteria en el proceso.
El virus replica su genoma circular empezando por un punto de ste, y desenrollando slo una de las dos hebras. El resultado es un genoma lineal muy largo, consistente en una
gran cantidad de repeticiones del genoma original de forma seguida, lo que se conoce como concatmero. El virus tambin sintetiza las protenas de su cpside, y se ensambla en
el citoplasma de la bacteria. Finalmente, la clula es lisada, liberando los viriones al medio.

(25)

e) Concepto Biblioteca genmica

Una biblioteca genmica debe representar la totalidad del genoma de un organismo como un conjunto de la superposicin de fragmentos clonados, que por lo
tanto, permiten el aislamiento de una secuencia en el genoma. Los fragmentos para la clonacin idealmente deben ser generadas por un procedimiento
independiente de secuencia, para asegurar que los fragmentos sean generados al azar y por lo tanto no exista un sesgo hacia una secuencia particular. Por
ltimo, los fragmentos clonados deben ser mantenidos en forma estable, sin tergiversacin de las secuencias debido a la recombinacin o diferencial la
replicacin del ADN clonado durante la propagacin de los recombinantes. Si bien estos criterios pueden parecer bastante exigentes, los sistemas de disponibles
para la produccin de bibliotecas genmicas permiten estos requisitos que deben cumplir ms o menos completamente.
La primera consideracin en la construccin de una biblioteca genmica es el nmero de clones necesarios. Esto depende de una variedad de factores, la ms
evidente es el tamao del genoma. Por lo tanto, un genoma pequeo como la de E. coli se requieren menos clones de un proceso ms complejo tales como el
genoma humano. El tipo de vector que se utilizar Tambin hay que considerar, que determinar el tamao de los fragmentos que se pueden clonar. En la
prctica, el tamao de la biblioteca se puede calcular simplemente sobre la base de la probabilidad de que una secuencia particular de ser representados en la
biblioteca. Hay una frmula que tenga en cuenta todos los factores y produce un "nmero de clones de valor. la frmula es la siguiente:
donde N es el nmero de clones necesarios, P es la probabilidad de que desee de una secuencia particular de ser representado (tpicamente fijado en 0,95 o
0,99), a es el tamao medio de los fragmentos de ADN para ser clonado, y b es el tamao del genoma (expresada en las mismas unidades que a). Mediante el
uso de esta frmula, es posible determinar la magnitud de la tarea y planificar una estrategia de la clonacin en consecuencia. Algunos tamao del genoma y el
tamao de sus bibliotecas asociadas se muestran en la Tabla 6.2. Estos tamaos de la biblioteca deben ser considerados como valores mnimos, como la
generacin de fragmentos clonados no pueden proporcionar un completo conjunto aleatorio y representativo de los clones en la biblioteca. As, para un biblioteca
genmica humana, estamos hablando de unos 106 clones o ms en Para estar razonablemente seguro de aislar un determinado gen de copia nica secuencia.

(26) (27)

Tcnicas de purificacin del

ADN

a) Electroforesis

Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las biomolculas en

disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se trata de una tcnica
fundamentalmente analtica, aunque tambin se puede realizar con fines preparativos.
Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una velocidad
constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) con la resistencia al
avance (fuerza de friccin o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.

a) Electroforesis
La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones mecnicas y
corrientes de conveccin durante la separacin. En algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la
superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa friccin, por lo que el mecanismo principal de separacin es la
magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de soporte (geles, medios semislidos o
gelatinosos) estn formados por polmeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a travs de la cual
deben avanzar las molculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electrofortico. Como
consecuencia, la friccin es notable y los factores de forma y tamao adquieren una alta relevancia en la
separacin.

a) Electroforesis
Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.
Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la adsorcin; baja tincin de fondo; es posible
transparentarla o disolverla para detectar y recuperar los componentes separados.
Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn caliente (se hinchan). Actualmente se
utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.
Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (5060C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad.
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida.
Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se consiguen distintas porosidades, siempre menores que
la de los geles de agarosa

a) Electroforesis
Agarosa + poliacrilamida: porosidad intermedia.
Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sdico (Sodium Dodecyl Sulphate) es un detergente aninico que se
une a las protenas, desnaturalizndolas en una conformacin extendida recubierta de molculas de SDS. Como
consecuencia, el tamao de la molcula de protena es directamente proporcional a su longitud en aminocidos y
su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la recubre, que es tambin proporcional a la
longitud. Por lo tanto, la movilidad electrofortica de la protena depende exclusivamente de su masa molecular.

b) Nouthern & Southern y su aplicacion

Northern blot, hibridacin northern o ensayo northern
es una tcnica de deteccin de molculas de cido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla
compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un pptido dado en una muestra de ARN total). Para ello, se toma la
mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos de acuerdo con su tamao.
Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la que se efecta
la hibridacin de una sonda molecular marcada radiactiva o qumicamente.
El nombre de la tcnica deriva de la que detecta cido desoxirribonucleico (ADN), denominada Southern blot en honor
a su inventor, Edwin Southern (1975). En 1977, James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de
Stanford desarrollaron el northern blot y lo denominaron empleando el punto cardinal opuesto (northern,
septentrional en ingls, frente al meridional southern).
(29)(30)

b) Nouthern & Southern y su aplicacion

Aplicacin
El ensayo northern permite observar un patrn particular de expresin gentica entre tejidos, rganos, estadios del
desarrollo, niveles de estrs ambiental, infecciones causadas por patgenos y durante el curso del tratamiento de las
mismas. Esta tcnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresin de oncogenes y la desregulacin de genes
oncosupresores en clulas cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.
Los patrones de expresin obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes. Desde que el RNA se separ
por su tamao, las sondas contra el mismo pueden darnos una idea de su tamao, sugerir ayuste alternativo, o
motivos repetidos en la secuencia. La variacin en el tamao del producto de un gen puede adems indicarnos
deleciones o errores en el proceso de transcripcin. Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso
determinar que regin del RNA ha sido delecionada.
(29)(30)

b) Nouthern & Southern y su aplicacion

Southern blot, hibridacin Southern o, simplemente, Southern

es un mtodo de biologa molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla comple
de este cido nucleico. Para ello, emplea la tcnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los
fragmentos de ADN de acuerdo a su longitud y, despus, una transferencia a una membrana en la cual se efecta la
hibridacin de la sonda. Su nombre procede del apellido de su inventor, un bilogo ingls llamado Edwin Southern.
(31)(32)

Secuenciacin de cidos
nucleicos

a) Tcnica Sanger
El mtodo de secuenciacin por dideoxinucletidos, mejor conocido como el mtodo Sanger se basa en el proceso biolgico de la
replicacin del DNA. El mtodo de secuenciacin ideado por Sanger est basado en el empleo de dideoxinucletidos que carecen del
grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos nucletidos se incorpora a una cadena de DNA en crecimiento,
esta cadena no puede continuar elongndose. Esto es as ya que la DNA polimerasa necesita un grupo terminal 3 OH para aadir el
siguiente nucletido y el dideoxinucletido incorporado carece de este grupo hidroxilo.
El mtodo comienza una vez se asla y se clona el DNA que se desea secuenciar. Este DNA se desnaturaliza y se emplea una sola
hebra para la secuenciacin. En la secuenciacin se utiliza un cebador o primer que se encarga de suministrar el terminal 3OH que
necesita la DNA polimerasa para comenzar a elongar. Se preparan cuatro tubos de reaccin, cada uno con el DNA molde de hebra
sencilla que se desea secuenciar, con DNA polimerasa, con el primer y con los cuatro nucletidos trifosfatados.
A cada tubo se le aade una pequea proporcin de un dideoxinucletido trifosfato; un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con
ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos se producen cadenas de DNA de distintas longitudes, terminando todas en
el lugar en el que se incorpor el dideoxinucletido correspondiente aadido al tubo. Los productos de las 4 reacciones, cada una
conteniendo una pequea cantidad de uno de los cuatro dideoxinucletidos, son cargados en un gel y sometidos a electroforesis. As,
obtendremos un patrn de bandas en orden, del que deducir la secuencia del ADN introducido. (33)

b) Tecnica Qumica (Maxam-Gilbert)

el mtodo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificacin del fragmento de ADN que
se desea secuenciar. El tratamiento qumico genera rupturas en una pequea proporcin de uno o dos de
los cuatro nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los agentes qumicos
utilizados en cada caso son: DMS (G), cido frmico (A+G), hidrazina (C+T) e hidrazina ms sales (C).De
ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta
el primer lugar de "corte" en cada molcula.
Los fragmentos posteriormente se separan por tamao mediante electroforesis en gel, separando los
productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. El gel utilizado
presenta condiciones desnaturalizantes, y un contenido en poliacrilamida que vara entre un 6 y un 20%.
Para visualizar los fragmentos generados en cada reaccin, se hace una autoradiografa del mismo, lo
que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos
marcados con el radioistopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia.

c) PCR
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual
se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s
tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas
nuevamente. La reaccin en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus
Corporation en California, en la dcada de 1980.
Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y
era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de
desnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas
termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayora de
los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq),
Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean
mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer correccin de errores (Pfu, Vent).

(36)(37)

c) PCR
Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y
enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin. Muchos
termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente
invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena
conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores
tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensacin sobre los tubos de reaccin. Los
termocicladores ms antiguos carecan de este sistema y solucionaban el problema de la condensacin con una capa de
aceite en la parte superior de la mezcla de reaccin o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin mdica y
biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la
filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin de
huellas genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico de enfermedades
infecciosas.

(36)(37)

d) PCR en tiempo real

La PCR cuantitativa (en ingls, quantitative polymerase chain reaction; qPCR o Q-PCR) o PCR en tiempo real (en ingls real
time PCR) es una variante de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultneamente
cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificacin de cido desoxirribonucleico (ADN). Para ello emplea, del
mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores especficos, dNTPs, un tampn de
reaccin adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un
fluorforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluorforo a la longitud de
onda apropiada, permita medir la tasa de generacin de uno o ms productos especficos.1 Dicha medicin, se realiza luego
de cada ciclo de amplificacin y es por esto que tambin se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata,
simultnea). En muchos casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que
puede ser ADN complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por retrotranscripcin de cido ribonucleico (ARN); en
este caso, la tcnica es una RT-PCR cuantitativa o en tiempo real, o RT-Q-PCR. Debe evitarse la confusin con la tcnica
denominada PCR tras transcripcin inversa (RT-PCR, del ingls reverse transcriptase PCR), en la cual existe un paso de
retrotranscripcin de ARN a ADN pero que no necesariamente cuantifica el producto a tiempo real.

(38)(39)

d) PCR en tiempo real

La PCR cuantitativa junto a los chip de ADN son modernas metodologas para el estudio de la expresin gnica,
aunque otros mtodos tradicionales como el Northern blot, si bien, no con tanta precisin, tambin permiten su
abordaje.2 La variabilidad que se introduce en la cuantificacin y que conlleva a un error en la estima deriva de la
integridad de ADN, eficiencia enzimtica y otros muchos factores, por lo que se han desarrollado numerosos sistemas
de estandarizacin. Los hay para cuantificar de forma absoluta la expresin gnica, pero, de forma ms comn, se
orientan a la cuantificacin relativa del gen de estudio respecto de otro, denominado normalizador, que se selecciona
debido a su expresin casi constante; estos genes suelen denominarse, en ingls, house-keeping genes debido a que
suelen estar involucrados en funciones bsicas en la supervivencia celular, lo cual suele implicar una expresin
constitutiva.3 4 De este modo, efectuando en cada experimento la medicin de los genes de inters y dividindolos por
la expresin del gen normalizador seleccionado es posible comparar los primeros an sin conocer en trminos
absolutos su nivel de expresin. Los genes normalizadores ms empleados son aquellos que codifican para las
siguientes protenas: tubulina, gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa, albmina, ciclofilina, RNA ribosomales,

(38)(39)

Micro Arreglos

a) concepto
Un conjunto ordenado de genes en una pequea superficie (10,000 muestras por centmetro
cuadrado). Los micro arreglos de DNA son una nueva herramienta de la biologa molecular y las
ciencias genmicas. Posiblemente es una de las aplicaciones ms importantes para la informacin
obtenida de la secuenciacin sistemtica de los genomas completos.
En la actualidad existen varios tipos de impresores para los micro arreglos y los podemos separar
en dos clases principales: los de contacto, que como su nombre lo indica, deposita las muestras
haciendo contacto con la superficie y los piezoelctricos en los que un aplicador ultrasnico
deposita la muestra, aunque estos ltimos son tecnologas muy recientes y no abundaremos en
ellos. Tambin existe otro procedimiento para la impresin de micro arreglos y es el de la sntesis
de DNA directamente sobre la superficie.
(40)

Diagnostico Molecular

a) Concepto
Es un trmino general que engloba un conjunto de tcnicas de biologa molecular empleadas para la identificacin de los defectos
moleculares subyacentes en una enfermedad de carcter hereditario o bien para la deteccin de enfermedades infecciosas, ya sean de
origen vrico, bacteriano o fngico.
Algunos mtodos moleculares de diagnstico gentico son:
1.

Anlisis cromosmico. Consiste en observar si el cariotipo del paciente es normal, es decir, si el nmero de cromosomas es el
correcto y si su tamao y orden es normal.

2.

Hibridacin fluorescente in situ o FISH. Con esta tcnica se pueden detectar anomalas cromosmicas, deleciones en un gen y
otras alteraciones que pueden provocar una enfermedad gentica.

3.

Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR. Este mtodo basado en la amplificacin y visualizacin del ADN, es muy til para el
diagnstico gentico. La realizacin vara dependiendo de la enfermedad a detectar, pero en general, consiste en propiciar la
amplificacin del fragmento de ADN que supuestamente posee la mutacin que genera la enfermedad, y realizar sobre este fragmento
una prueba accesoria, como el uso especfico de alguna enzima de restriccin, hibridacin de microsatlites u otras pruebas.

4.

Secuenciacin de ADN. La secuenciacin directa del ADN es uno de los mejores mtodos para el diagnstico molecular, ya que
consiste en la lectura del gen o genes implicados en una enfermedad y la comprobacin directa de que existe o no alguna mutacin.
Actualmente, la secuenciacin se usa muy poco ya que es una tcnica muy cara, laboriosa y en la mayor parte de los casos sustituible
por otra tcnica molecular.

(41)

Terapia Gnica

a( Concepto
La terapia gnica consiste en la insercin de genes funcionales ausentes en el genoma de un
individuo. Se realiza en las clulas y tejidos con el objetivo de tratar una enfermedad o realizar un
marcaje.
La tcnica todava est en desarrollo, motivo por el cual su aplicacin se lleva principalmente a cabo
dentro de ensayos clnicos controlados, y para el tratamiento de enfermedades severas o bien de tipo
hereditario o adquirido. Al principio se plante slo para el tratamiento de enfermedades genticas,
pero hoy en da se plantea ya para casi cualquier enfermedad.
Entre los criterios para elegir este tipo de terapia se encuentran:
1.

Enfermedad letal sin tratamiento.

2.

La causa sea un nico gen que est ya clonado.

3.

La regulacin del gen sea precisa y conocida

a.1) Usos y aplicaciones

a.2) lo mas nuevo

Farmacologia Molecular

a) Usos y Aplicaciones

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