La ingeniera metablica de

Thermoanaerobacterium
saccharolyticum
para la produccin de n-butanol
Ashwini Bhandiwad , A. Joe Shaw , Adam Guss., Anna
Guseva., Hubert Bahl.,Lee R.

Esfuerzos para obtener de forma sustentable combustibles a partir

de biomasa.

Ha llamado la atencin gracias a sus propiedades

fisicoqumicas.
Menos higroscpico
Mayor contenido energtico
Mayor compatibilidad con la gasolina
Menos corrosivo

Thermoanaerobacterium
saccharolyticum

Produccin de n-butanol
a concentraciones
significativas.

Thermoanaerobacterium
saccharolyticum JW/SL-YS485
Ha sido bien caracterizada y extensivamente manipulada.
Gram positiva.
Termfila.
Anaerobia.
Aislada
del parque nacional de Yellowstone en
Estados Unidos y crecen a unas temperaturas
entre 45 - 65C y en un pH entre 4 y 6.8

T. Saccharolyticum es capaz de utilizar gran variedad de azucares

encontrados en la biomasa celulsica.

Celobiosa
Glucosa
Xilosa
Manosa
Galactosa
Arabinosa

Naturalmente competente para

manipulaciones genticas.
Tambin ha sido modificada para la produccin de etanol
a altas concentraciones mediante la delecin de genes:
o cidos Orgnicos
o H2

VA DEL N-BUTANOL
Clostridium acetobutylicum

Genes implicados:
thl, hbd, crt, bcd,
etfA, etfAB, adhE2
and adhE1

Ezimas: tiolasa, hidroxibutiril CoA

deshidrogenasa,
crotonasas, butirilo
CoA
deshidrogenasa

Flavoprotenas de
transferencia de
electrones
subunidad A y B y
la enzima bifuncional aldehdo
alcohol
deshidrogenasa.

Thermoanaerobacterium
thermosaccharolyticum cepa DSM 571
Produce N-BUTANOL pero inconsistentemente
La via no ha sido caracterizada, pero se han encontrado genes
responsables de la produccin de N-BUTANOL en su genoma,
recientemente secuenciado.
Los genes crt, bcd, etfB, etfA, hbd y thl son parte de un
opern, responsable de la formacin de butiril CoA.

Thermoanaerobacterium saccharolyticum
cepa JW/SL-YS485
Termfilo(45 y 65 C)
estrechamente
relacionado
con
T.
thermosaccharolyticu
m
Caracterizado
desarrollado
ampliamente
Gram +
Anaerobio

Variedad de azucares:
celobiosa, glucosa, xilosa,
manosa, galactosa,
arabinosa.
Hidroliza el xilano, manano,
almidn y pectina.
Propio para manipulacin
gentica.
Utilizado para la produccin
de etanol
Conveniente para la
produccin de N-BUTANOL

METODOLOGA
Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano
Experimentos de transformacin T. saccharolyticum
Medio TSC1 5 g de celobiosa fuente de C
El pH se ajust a 6,7 para la seleccin en kanamicina
Comparaciones de crecimiento
Medio TSD La fuente de carbono fue de 10 g de xilosa
pH se ajust a 6,1.
E.coli
medio LBpeptona de casena y el extracto de levadura
Saccharomyces cerevisiae
YPDExtracto de peptona, glucosa y dextrosa

Construccin de plsmidos
Tecnicas de clonacin con levaduras estndar Construccin de
plsmidos que expresan genes individuales de la va de n-butano
Gen/Cluster de inters para Gen/cluster de inters para
la codificacin de cada paso la codificacin de cada paso
enzimtico en T.
enzimtico en C.
thermosaccharolyticum
acetobutylicum ATCC824
thl (Tthe_1656)

DSM571

hbd (The_1657)

adhE2 (CA_P0035)

crt (Tthe_1661)
bcd (Tthe_1660)
etfA (The_1658)
etfB (The_1659)

Son fusionados con el promotor pta-ack de T.

saccharolyticum silvestre
Los genes fueron individualmente clonados en el
plsmido pYC2 / CT para la insercin cromosmica
de un casete gentico para la resistencia a la
kinamicina.
El plsmido pBu24 se construy en E. coli
utilizando el montaje Gibson para la expresin de
la totalidad de la va de n-butanol.

Construccin de cepas de T. saccharolyticum

Cinco colonias de T.
El ADN para la transformacin fue amplificado
mediante PCR incluidas las regiones del
locus
saccharolyticum
pta -ACK y el gen de resistencia a la
Inoculacion 10 mL de medio
kanamicina.
resistentes a la kanamicinaTSC1
Cmara anaerbica

La cepa M0355 homo etanolognica

deexperimento
T.
por
de 1 L de la cepa parental
saccharolytcum se transform con los
productos de PCR para crear cepas
Athl ,
transformacin,
fueroncongelada
1ml del cultivo se aadi a tubos
Ahbd , ACRT , Abcd - etfAB y AadhE.

evaluadas por la
que contenan 500ng de ADN
La transformacin del plsmido no replicativo,
pBu24 se intento en cuatro cepas
de T.
integracin
cromosomallineal o plasmido.
saccharolyticum para la integracin
cromosmica del tipo salvaje: por PCR, usando primers
M0210
M0350
M0355

Incubacion: 15-18 Hrs 55C

externos al sitio de
integracin, siguiendo la Las diluciones se suspendieron
TSC1 fundido pH 6,7 y se
secuencia de verificacin. en
deja solidificar antes de la
incubacin

Ensayos enzimticos
Preparacin de extractos libres de clulas

Se obtuvo por centrifugacin a 14.000 g durante 25 min y la

eliminacin de los restos celulares.
Concentracin de protenas
Absorbancia
Tiolasa

reactivo de Bradford

Espectrofotmetro
escisin del Acetil CoA

La actividad de la -Hydroxybutyryl CoA dehidrogenasa

Consumo de NADPH
Crotonasa

hidratacin del crotonil CoA

Actividad de la Butiril CoA dehidrogenasa:

1. Disminucin en la absorbancia y consumo de ferroceno
2. Monitoreo del consumo de NADH

Butiraldehdo deshidrogenasa
NADPH (cofactor)

Consumo de

Butanol deshidrogenasa
Metodos de anlisis
Productos de fermentacin

cromatografa lquida

Deteccin de la metabolitos

ndice De refraccin

El hidrgeno

cromatografa de gases.

Carbono y electrones de
equilibrio

Balances de carbono
calculo de moles de carbono en los
productos y los sustratos consumidos el CO2 era representado por la
produccin estequiometria del acido actico, etanol y butanol.
Carbono en el peso celular seco
composicin de clulas.
Balances de electrones
sustrato y de los productos

frmula general para la

electrones disponibles por mol del

Resultados
SE DIVIDEN EN 2 PARTES
Se evalu la expresin heterloga de las enzimas de la va
de produccin de n-butanol (una a la vez) en T.
saccharolyticum. Los organismos fuente fueron T.
thermosaccharolyticum y C. acetobutylicum.
Despus de la evaluacin de las enzimas individuales, se
expres la va completa en 2 cepas de T. saccharolyticum
para demostrar la produccin heterloga n-butanol.

Cepas parentales El T.
saccharolyticum - WT,
Las
actividades
de- las
M0355
y M0210
no dos
primeraas
en T.
mostraron
actividad
saccharolyticum
detectablefueron de
aproximadamente 1,5-3
veces menor que las
actividades medidas para
C. acetobutylicum

T.t, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum; T.s., Thermoanaerobacterium

saccharolyticum; C.a., Clostridium acetobutylicum; C.k., Clostridium kluyveri.

Actividad global de las

tres cepas de ingeniera Aadhe, I2B y M0210-V - se
han mejorado en
comparacin con el cepas
parentales - M0355,
M0210 y WT.

T.t, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum; T.s., Thermoanaerobacterium

saccharolyticum; C.a., Clostridium acetobutylicum; C.k., Clostridium kluyveri.

Fig. 3. Va metablica para la produccin de n-butanol en T. saccharolyticum.

fig. 4. curvas de crecimiento que representan las fermentaciones de productos

finales de cepas de T. saccharolyticum hasta 60 h

(A) WT, (B) I2B, (C) M0210, y (D) M0210-V

La produccin de etanol
La produccin de cido actico
se reduce en
aumenta en 46% y 67% en las
aproximadamente 50% en
cepas I2B y M0210-V,
respuesta a la produccin
respectivamente
de butanol

Discusin y conclusiones
En este estudio se demostr la produccin heterloga de n-butanol
en un husped termoflico T. saccharolyticum.
La produccin de n-butanol a travs de una va metablica sinttica
fue lograda en WT (wild type) y la cepa Del-ldh de T.
saccharolyticum; esto no fue demostrable en cepas donde la
produccin de acetato era deficiente.
Hay una aparente letalidad en la produccin de n-butanol SI NO SE
PRODUCE TAMBIN cido actico.
Se observ que la produccin de acetato increment en las cepas
productoras de butanol 12B y M0210-V

Discusin y conclusiones
La va que produce n-butanol en C.acetobutylicum a partir de
glucosa requiere 2 acetil-coA, dos NADH y dos NADPH por cada
molcula de n-butanol que se produce.
Sin embargo, un investigador determin que se necesitan tres
NADH no 2. Algo similar se encontr en los experimentos que se
llevaron a cabo en este estudio.