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Reaccin de la ninhidrina
(espectrofotomtrica)
Cromatografa de
intercambio catinico
Actualmente: HPLC
Homogenado
Homogenado
celular
SOBRENADANTE
1
SOBRENADANTE
2
SOBRENADANTE
3
Velocidad
media
20000g, 20min
Velocidad alta
80000g, 1h
Velocidad
muy alta
150000g, 1h
PRECIPITADO 1
Clulas enteras,
ncleos,
citoesqueleto
PRECIPITADO 2
mitocondrias,
lisosomas,
peroxisomas
PRECIPITADO 3
Microsomas,
otras vesculas
pequeas
PRECIPITADO 4
Ribosomas,virus
macromolculas
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CENTRIFUGACIN ISOPCNICA
Centrifugacin
Muestra
Gradiente de
sacarosa
Componente
menos denso
Fraccionamiento
Componente
mas denso
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SEPARACIN DE PROTENAS
CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Las diferentes protenas se retrasan segn sus interacciones con la
matriz, de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamao o unin a
El solvente se aplica
grupos qumicos
Muestra contnuamente a la
aplicada boca de la columna
Matriz
slida
Molculas fraccionadas
eludas y recogidas
Tapn
poroso
Tubo de
ensayo
tiempo
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Flujo de solvente
C) de Afinidad:
B) Filtracin en gel:
en base al tamao
Flujo de solvente
Flujo de solvente
Partcula cargada
positivamente
Partculas porosas
Molcula cargada
negativamente
unida
Molcula cargada
positivamente
libre
Molcula pequea
retrasada
Molcula grande
no retrasada
Partcula con
sustrato unido
covalentemente
Molcula de
enzima unida
Otras protenas
pasan de largo
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C: CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Las protenas se separan en funcin de la
especificidad de unin a un ligando. En este ejemplo
el ligando es la glucosa y se separan aquellas
protenas que se unen a ella. Las protenas de inters
se eluyen aadiendo un exceso de ligando libre.
ELECTROFORESIS EN GEL
ELECTROFORESIS EN GEL:
Tras aplicar un campo elctrico las
protenas migran en funcin del
tamao y de la carga
Electroforesis en SDS-PAGE
(solubiliza
protenas)
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ISOELECTROENFOQUE
Es un tipo de electroforesis en gel con anfolitos que crean un
gradiente de pH. Cada protena migra hasta su punto
isoelctrico.
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PM
e
d
r
do
a
c
ar
M
PM
e
d
GELES
BIDIMENSIONALES (2D)
Primero isoelectroenfoque y
luego SDS-PAGE
Se basa en la diferente:
Solubilidad
Tamao
Carga elctrica
Densidad (centrifugacin)
Afinidad por otras molculas
(Voet)