ANLISIS INSTRUMENTAL II

INTRODUCCION A LOS MTODOS COROMATOGRFICOS

CLSICOS

SEPARACIN ANALTICA
MEZCLAS HETEROGNEAS
MECNICAS

SEPARACIONES

MEZCLAS HOMOGNEAS
SEPARACIONES
FISICAS
SEPARACIONES QUMICAS

SEPARACIN DE ANALITOS
Alternativas:
Mtodos especficos
Aplicabilidad limitada (selectividad, lmites de
deteccin, no simultaneidad)
Mtodos tradicionales o clsicos de separacin
Destilacin
Extraccin
Precipitacin
Tcnicas instrumentales

TCNICAS INSTRUMENTALES
Cromatografa
Electroforesis
Otras

CROMATOGRAFA
Invencin de principios del siglo XX
Herramienta poderosa por su versatilidad
Ventajas
Mezclas complejas
Variedad de matrices y analitos
Alto porcentaje de recuperacin
Fcil cuantificacin
Acoplamiento de la separacin con la
caracterizacin

Invencin de la cromatografa: Mikhail Tswett (1906)

If a petroleum ether solution of chlorophyll filters through a column of an adsorption material (I use chiefly
calcium carbonate which is firmly pressed into a narrow glass tube), the pigments will separate according to
the adsorption series from above downward in differently colored zones, and the more strongly adsorbed
pigments will displace the more weakly held ones which will move downward. This separation will be
practically complete if, after one passage of the pigment solution it is followed, by a stream of pure solvent
through the adsorbing column. Like the light rays of the spectrum, the different components of a pigment
mixture in the calcium carbonate column will be separated regularly from each other, and can be
determined qualitatively and also quantitatively. I call such a preparation a chromatogram and the
corresponding method the chromatographic method.
Berichte der Deutschen botanischen Gesellschaft 24, 316-23 (1906) [traducido en: Henry M. Leicester,
Source Book in chemistry 1900-1950 (Cambridge, MA: Harvard, 1968)]

Descripcin general de la cromatografa

Cromatografa es un mtodo de separacin que permite separar componentes de mezclas
complejas. La muestra se desplaza con una fase mvil (gas, lquido, fluido supercrtico) que
se hace pasar sobre una fase estacionaria con la que es inmiscible y que se fija a una
columna o superficie slida.
Las dos fases se elijen de tal modo que los componentes se distribuyen de modo distinto
entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente
retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil. Por el
contrario, los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con
rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se
separan en bandas que pueden analizarse cualitativa y cuantitativamente.

Mtodo fsico de separacin en el cual los componentes a

separar se distribuyen entre dos fases, una de la cual es
estacionaria (fase estacionaria) mientras que la otra (fase
mvil) se mueve en una direccin definida. IUPAC

Clasificacin de la Cromatografa
Cromatografa en Plano

La fase estacionaria se fija sobre una

placa plana y la fase mvil se desplaza
a travs de la fase estacionaria por
capilaridad.

Cromatografa en Columna

Un tubo estrecho contiene la

fase estacionaria a travs de la
cual se hace pasar la fase
mvil por presin.

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS

La clasificacin ms fundamental de los mtodos cromatogrficos se

basa en el tipo de fase mvil y estacionaria, y en la clase de equilibrios
implicados en la transferencia de los solutos entre las fases, en el
cuadro adjunto se resumen los mtodos cromatogrficos

Tipos de cromatografa en columna

Otra clasificacin se basa en el tipo de fase mvil, tres clases generales de
cromatografa donde la fase mvil son lquidos, gases o fluidos supercrticos.

Elucin en columna
Dilucin del analito: el tamao de la banda original
que contiene los analitos es ms pequea que las
zonas que llegan al detector. Por lo tanto los detectores
deben ser ms sensibles que los que seran necesarios
si no fuera imprescindible la separacin.

A medida que aumenta la migracin, aumenta la

distancia entre las bandas, pero estas se
ensanchan, disminuyendo la eficacia de la columna.

Cromatograma: La posicin de los picos en el

eje del tiempo puede servir para identificar los
componentes de la muestra y el rea bajo la
curva proporcionan una medida cuantitativa de
la cantidad de cada componente.

Las formas de los picos cromatogrficos

La teora cintica de la cromatografa explica las formas de los picos y los efectos de
distintas variables sobre el ancho de los mismos.
Las bandas cromatogrficas ideales tienen forma gaussiana y se puede atribuir a la
combinacin aditiva de los movimientos aleatorios de las numerosas molculas de soluto en
la banda cromatogrfica.
Una molcula de soluto experimenta miles de transferencias entre la fase estacionaria y la
fase mvil durante la migracin. El tiempo que pasa en cada una es muy irregular y depende
que gane accidentalmente suficiente energa trmica del medio para que se produzca la
transferencia. Dado que la molcula se eluye solamente cuando reside en la fase mvil, su
migracin a travs de la columna es muy irregular. Ciertas molculas se desplazan con
rapidez, otras se retrasan debido a que han sido retenidas mayor tiempo que el promedio en
la fase estacionaria. La consecuencia de estos procesos individuales aleatorios es una
dispersin simtrica de las velocidades alrededor del valor medio.
El ancho de la banda aumenta a medida que se mueve a travs de la columna, debido a que
se dispone de ms tiempo para que la dispersin tenga lugar. El ancho de la banda est
relacionado directamente con el tiempo de residencia en la columna e inversamente
con la velocidad con la que fluye la fase mvil.

Efectos de las velocidades de migracin y del

ensanchamiento de banda sobre la resolucin

El primer componente avanza en la

columna a mayor velocidad

Disminucin del ensanchamiento

de bandas

Optimizar la separacin implica: (i) modificar la velocidad relativa de

migracin de los componentes y (ii) reducir el ensanchamiento de banda.
Qu factores determinan (i) y (ii)?

Velocidades de migracin de los solutos

Velocidad lineal promedio de migracin

Fase mvil

Soluto

L
tM
L

v tR

constante de distribucin: cromatografa lineal

cS

K cM

Amvil

Tener en cuenta que NO hay un equilibrio ya que

no se puede alcanzar con la fase mvil movindose
continuamente

cM VM
1
1

v t u cM VM cSVS
1
KV
/V
1
k
S
M
R
A

Aestacionaria
L

Factor de retencin

K VS

k A VA
M

tR tM
tM

Factor de selectividad (definido mayor que 1)

k B (t R ) B t M
K A k A (t R ) A
KB

Efecto de la isoterma
Se asume que la constante de distribucin es constante y por lo tanto un grfico de C(S)
vs C(M) es lineal.
Isotermas no lineales (C(S) vs C(M) a T cte) se observan en ciertos casos y resultan en
picos asimtricos y tiempos de retencin que dependen en la concentracin del analito
en la fase movil y por lo tanto en el tamao de las muestras inyectadas.

C(S)

C(M)

Eficacia de la columna
L

NH

La eficacia de la columna aumenta cuanto mayor es el nmero de platos

(N) y cuanto menor es la altura del plato (H). (L es la longitud del relleno de
la columna). Tanto N como H se toman como medidas de la eficacia de la
columna.
El ancho de la curva gaussiana est
relacionado con la varianza o la desviacin
estndar. Y definimos la eficacia en los
trminos de la varianza por unidad de longitud.
Por lo tanto, H y N se pueden determinar a
partir de un cromatograma:

LW
tR
H 16t N 16(W
)
R
2

Modelo de platos de Martin y Synge no representa la realidad (aunque predice forma

Gaussiana no justifica el ensanchamiento del pico): modelo de la velocidad

Teora de van Deemter

Tomamos a H como una medida inversa de la eficacia de la columna

H A u Cu
A
2d
B

Caminos mltiples
de flujo

2DM
u

Difusin longitudinal

Transferencia de
masa entre las fases

Cu (CS CM )u
f S (k )d f2

(2

DS

f M (k )d p
DM

)u

Coeficientes A, B y C
Trmino del camino mltiple (A): El ensanchamiento de banda
surge en parte debido a la multitud de caminos por los cuales las
molculas pueden caminar a travs de la columna rellena. La
longitud de estos caminos puede diferir significativamente y por lo
tanto el pico se ensancha.
Trmino de la difusin longitudinal (B/u): Los solutos difunden
desde la zona central donde es mayor la concentracin hacia las
regiones ms diluidas situadas por delante y por detrs de la banda,
es decir en el mismo sentido y en el sentido opuesto del flujo de la
fase mvil. Cuanto mayor es el flujo, menos sucede la difusin del
centro de la banda a los costados y menor es el ensanchamiento.
Trmino de transferencia de masa (C u): Las columnas
cromatogrficas siempre trabajan en condiciones alejadas del
equilibrio entre la fase mvil y la fase estacionaria. Se requiere un
tiempo para que el analito difunda desde una fase hacia la interfase
para que se produzca la transferencia y esto ensancha el pico. El
ensanchamiento por transferencia de masa se debe a la difusin que
tiende a ocurrir perpendicularmente a la direccin de flujo y por lo
tanto cuanto mayor es la velocidad de flujo, menos tiempo hay para
que se produzca la transferencia y menor es el ancho del pico.

Efecto del tamao de partcula en la eficacia de

la columna

El dimetro de las partculas que constituyen el relleno de la

columna afectan la eficacia de la columna.

Resolucin
t
wB wA )

2(t

N ( R,B
1)
R
4

R, A

k B
'

1 kB'

Para una fase estacionaria

determinada, la resolucin
puede aumentarse
alargando la columna (y as
aumentando el nmero de
platos). La consecuencia
negativa es el incremento del
tiempo requerido para la
separacin.

Eficiencia de la separacin
N = L/H columna, efectos cinticos, ensanchamiento de banda

N
R
4

A,B 1
A,B

kB

1 ' kB
'

Particin f.mvil/f.estacionaria, efectos termodinmicos

t R,B L NH (1 k B ) 16RS H ( ) 2 (1 2k B )
u
u

kb
vB
1 resolucin en el menor tiempo posible,
Si bien se busca la mejor
pero las dos propiedades no se pueden llevar a su mximo para
las mismas condiciones

Influencia del factor de retencin

k ptimo entre 2 y 5 aproximadamente

Variables que afectan la eficacia de la columna

Al buscar las condiciones ptimas debe tenerse en cuenta que los
parmetros fundamentales , ky N (o H) pueden ajustar ms o
menos independientemente.
La manera ms fcil de modificar y kes variando la temperatura
o la composicin de la fase mvil o el relleno de la columna. Es
posible cambiar N modificando la longitud de la columna y H por
alteracin del caudal de fase mvil, el tamao de la partcula de
relleno y la viscosidad de la fase mvil.
Se puede aumentar la resolucin aumentando el nmero de platos
tericos de la columna, pero esto es costoso en trminos del
tiempo necesario para completar la separacin, a no ser que el
aumento de N se lleve a cabo mediante una reduccin de H.

Efecto del solvente

Ejemplo: variacin del factor de selectividad variando el solvente

El problema de la elucin

Solucin: cambiar las condiciones que determinan kmientras tiene

lugar la separacin (por etapas o de forma continua), por ejemplo:
variar la composicin de la fase mvil (CL) o variar T (CG).

Efecto de la temperatura