ESPECTROFOTOMETRA

Definicin

Mtodo de anlisis ptico ms usado en las

investigaciones biolgicas.
El espectrofotmetro es un instrumento que

permite comparar la radiacin absorbida o

transmitida por una solucin que contiene una
cantidad desconocida de soluto, y una que contiene
una cantidad conocida de la misma sustancia

ESPECTROFOTMETRO

1.

2.
3.

4.

Un espectrofotmetro tpico posee cuatro

componentes bsicos:
una fuente de radiacin que tiene intensidad
constante en el rango de longitud de onda que
cubre ( usualmente es lmpara de tungsteno
para luz visible,y deuterio para ultravioleta),
un compartimiento para la muestra,
un monocromador que separa la banda de
longitud de onda deseada del resto del espectro
y la dispersa al compartimiento de la muestra, y
un fotodetector, que mide cuantitativamente
la radiacin que pasa por la muestra.

ESPECTROFOTMETRO

LUZ VISIBLE

Es una regin muy

estrecha pero la ms
importante, ya que
nuestra
retina
es
sensible
a
las
radiaciones de estas
frecuencias.

A su vez, se subdivide
en seis intervalos que
definen los colores
bsicos (rojo, naranja,
amarillo, verde, azul y
violeta).

Espectrofotmetro
La luz monocromtica atraviesa la muestra, y llega al detector.

Las mediciones fotomtricas se hacen en base a la relacin

entre la potencia de luz que alcanza al detector cuando est
interpuesta la muestra (P) y cuando no lo est (P0) o cuando
est interpuesto un blanco.

Espectro de absorcin caracterstico

Espectro de emisin caracterstico

 Se acostumbra a llamar cuerpo

negro al

cuerpo ideal que absorbe todas las longitudes de

onda y, por consiguiente, emite radiacin tambin a
todas las longitudes de onda. Sera, en definitiva,
un emisor perfecto de radiacin. A cada
temperatura emitira una cantidad definida de
energa por cada longitud de onda.

Transmitancia y absorbancia
La transmitancia se define como T = P / P0
y la absorbancia como

A = - log T = - log P / P0

Espectrofotmetro puede registrar la

luz en el rango de UV o del visible
Al campo de luz UV de 200 a 400 nm

se le conoce tambin como rango de

UV cercano , la espectrofotometra
visible solamente usa el rango del
campo electromagntico de la luz
visible , de 400 a 800 nm.

Ley de Lambert - Beer

Relaciona la absorcin de luz con

las propiedades del material

atravesado.

LEY DE LAMBERT Y BEER

La ley explica que hay una relacin exponencial entre la

transmisin de luz a travs de una sustancia y la

concentracin de la sustancia, as como tambin entre la
transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa.
Si conocemos l y A, la concentracin de la sustancia
puede ser deducida a partir de la cantidad de luz
transmitida.

A = cl

Donde:
A = absorbencia
= Coeficiente de extincin molar.
l = longitud de la celda.

COEFICIENTE DE EXTINCIN
MOLAR
Es una medida de la cantidad de luz absorbida

por unidad de concentracin.

Un compuesto con un alto valor de coeficiente de

extincin molar es muy eficiente en la absorcin

de luz de la longitud de onda adecuada y, por lo
tanto, puede detectarse por medidas de
absorcin cuando se encuentra en disolucin a
concentraciones muy BAJAS.

CURVA PATRN BLANCO

La absorbancia de una solucin es la resultante de la

absorbancia del soluto cuya concentracin se desea conocer y

la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que
absorben tambin a esa longitud de onda.
Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para

ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga

todas los componentes del sistema menos aquel que se desea
medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de ste
debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien,
con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0,
o sea 100% de transmitancia.

CURVA PATRN