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e INMUNOBLOT
Inmunoprecipitacin
confirmar la identidad de
una protena, para
cuantificar los niveles de
expresin o para evaluar
las modificaciones
posteriores a la
traduccin.
Determina la presencia y
cantidad de un antgeno,
sntesis y degradacin de
proteinas y otros ligandos
Inmunoprecipitacin
confirmar la identidad de
una protena, para
cuantificar los niveles de
expresin o para evaluar
las modificaciones
posteriores a la
traduccin.
Determina la presencia y
cantidad de un antgeno,
sntesis y degradacin de
proteinas y otros ligandos
Etapas:
1. Marcaje del antgeno
2. Preparacin de las muestras:
Lisis de las clulas para liberar
el Ag
3. Formacin del complejo AgAc
4. Precipitacin de los complejos
Ag-Ac
5. Purificacin de los
inmunocomplejos
6. Anlisis
Suspender el
sedimento en
1ml de tampn
de lisis
Vortex suave,
dejar 30 min en
hielo (mezclar)
Recoger
cuidadosame
nte en un
tubo limpio
Desechar
sobrenadan
te y repetir
Centrifugar a
10.000 G (15 a
30 minutos a 4
C).
Congelar el
lisado de
clulas a
-80C para
almacenarlo
Preparacin de la
inmunopreparacin
Aadir 1-10 mg
de anticuerpo al
lisado celular
Incubar
durante 1 hora
o durante la
noche a 4 C
en un rotador.
Al
sobrenadante
aadir 50 l
de tampn 1X
de Laemmli
Incubar a 4 C
(1 a 2 horas o
durante la
noche) en un
rotador
Centrifugar el
tubo a 2,500 G
(30 segundos a
4 C).
50 l de
protena A
o G a la
suspensin
3a5
veces
Retirar todo el
sobrenadante.
Lavar con 500
l de tampn
de lisis (Fro)
Recoger el
sobrenadante
y cargar en
un gel de
SDS-PAGE
SDS-PAGE
(Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sdico)
Separar las
protenasde
acuerdo a su
movilidad
electrofortica (en
funcin de la
longitud de la
cadena
polipeptdica,
masa molecular,
modificaciones
postraduccionales)
Inmunoblot
Permite detectar
la presencia,
cantidad y calidad
de un antgeno en
una mezcla
compleja
Consiste en:
1.-Rotura de las clulas o tejidos
con un tampn apropiado.
2.- Electroforesis del extracto
obtenido.
3.-Electrotransferencia de las
protenas a un soporte slido.
4.- Incubacin de la membrana
con el anticuerpo dirigido contra
el antgeno de inters (anticuerpo
primario). Posterior lavado con un
tampn.
5.-Incubacin con anticuerpo
secundario dirigido contra el
anticuerpo primario, por ejemplo
Inmunoblot
Clula: PBMC
Antigeno: Itk
Anticuerpo: anti-Itk
Las clulas se analizaron de forma
rutinaria 48 h despus de la
transfeccin.
Procedimientos estndar para la
SDS-PAGE y la inmunoblot.