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Mesure de lActivit

Enzymatique

Dr AKSAS

Mesure de lactivit enzymatique


Il est difficile de mesurer la quantit denzyme en
units de masse ou de concentration molaire
(quantit trop faible et problme de purification);
lactivit enzymatique est dfini en terme de
vitesse de raction (la V tant directement
proportionnelle la quantit denzyme).
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Mesure de lactivit
enzymatique
Cette mesure consiste valuer la
Q de :
S transform ou de P apparu par
unit

de

conditions

temps

dans

opratoires

des
bien

dtermines.
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Mesure de lactivit
enzymatique
Lactivit dune enzyme se
mesure:
1. Soit par la vitesse de disparition dun
substrat.
2. Soit par la vitesse dapparition dun
produit.
3. Soit par la vitesse dutilisation dun
cofacteur.
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Mthodes de mesure
2 Grandes Mthodes
Mthode en point final ou deux points
Mthodes cintiques:
1. Colorimtriques
2. UV : - directes;
- couples

Conditions opratoires
Conditions qui permettent davoir une
vitesse constante et maximale
a) Milieu tamponn pour viter toute variation du PH0
et dterminer la force ionique. Vrifier que le
tampon ne contient pas dinhibiteurs.
b) Milieu thermostat pour stabiliser la temprature
optimale
c) Choix du substrat : grande affinit et concentration
saturante
d) Ajout dactivateurs ou de coenzymes si ncessaire.
e) La dure dincubation
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Le substrat
Le S doit tre pour lequel lenzyme a le plus
daffinit (Km le plus faible)
Pour une [] de S = 10 Km, la Vi= 91 % Vm
Pour une [] de S = 100 Km, la Vi= 99 % Vm
Il en ressort de ces calculs que la [] optimale de S
doit tre > 100 Km
Mais
Un certain nombre de considration pratique :
solubilit du S, prix de revient, inhibition par excs
de S, etc., fait que pour les dosages au labo:
on exige que S > 10 Km.
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Temprature
En biologie chimique trois tempratures sont
conventionnellement utilises : 25, 30 et 37C.
La commission des enzymes de la SFBC (socit
franaise de biologie clinique) prconise la
temprature de 30C .

La dure de la mesure
AE = Vi en [ ] saturante de substrat
Priode initiale, qui est la dure pendant
laquelle une proportion inferieure 10% de la
concentration initiale du substrat a t consomme
= phase stationnaire.

Le Tmoin
Dans les mthodes 2 points
On utilise une prise dessai identique mais dans laquelle on
a inactiv lenzyme.
Ce tmoin est ncessaire lorsque le produit de la raction
que lon dose prexiste dans lchantillon.

Dans les mthodes cintiques


On ne fait gnralement pas de tmoin, le zro optique de
lappareil est fait sur lessai de temps zro.
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Les units enzymatiques


Le rendement de la purification =
Activit enzymatique totale de lextrait / Activit
enzymatique totale de dpart
(x 100 % pour lexprimer en %)
Le taux de purification =
Activit spcifique de lextrait / Activit
spcifique de dpart
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I- Mthode en point final


ou 2 points

Principe du dosage
Cest le procd classiquement utilis en mthode
manuelle. Il consiste :
1. Laisser lenzyme catalyser la raction pendant une
dure dtermine dincubation,
2. arrter son action,
3. Puis ajouter un ractif qui ragit avec le S ou le P et
avec lequel il est capable de donner un produit
color dont lintensit de coloration, lue une
dtermine, est directement lAE.

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La dure de la raction

Cette dure doit tre mesur avec une extrme


prcision .
Le temps (0) est celui ou la raction est dclenche
lorsque la dure dincubation sest coule, il est
ncessaire de bloque la raction :
soit en refroidissant brutalement,
soit en se plaant rapidement en dehors de la
zone de PH0 en ajoutant un acide ou une base,
soit en ajoutant un dnaturant denzyme.

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Le Tmoin
Faire un tmoin en utilisant une prise dessai
identique mais dans laquelle on a inactiv
lenzyme.
Ce tmoin est ncessaire lorsque le produit de la
raction que lon dose prexiste dans lchantillon
Exemple le dosage du phosphatase srique
avec mesure de phosphate libr
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Dosage colorimtrique de lALAT


-ctoglutarate + L-Alanine

ALAT Glutamate + Pyruvate

- Tampon contenant: L-Ala et -ctoglutarate;


- Prise dessai de srum contenant lenzyme doser;
- Incubation du mlange pendant 30 min 37.
- Additionner

le

ractif

de

phnylhydrazine (agit sur PYR)

coloration:

Dinitro-2,4

P color rouge brun

(Dinitrophnylhydrazone );

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Dosage colorimtrique de lALAT


- Lcture de la DO 530-546 nm aprs 20 min
dincubation 25C;
- Calcul de lAE aprs ralisation dun talon ou
dtermination

graphique

aprs

ralisation

dune courbe dtalonnage laide dune


solution mre de PYR.

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II - Mthodes cintiques

Principe du dosage
Sadapte parfaitement lanalyse automatique;
Consiste suivre lvolution de la raction en fonction de
temps
La substance dont on mesure la vitesse de disparition ou
dapparition doit possder une proprit spectrale spcifique
dans lUV ou le visible;
lorsquaucune de ces conditions nest runie, on opre
laide de ractions couples appeles ractions indicatrices.
Lenregistrement des variations dabsorbance en f du
temps est la technique la plus simple, la plus rapide et la
plus spcifique.
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Cintique enzymatique en Ultra-Violet


Le

couple

NAD/NADH

ou

NADP/NADPH

est

usuellement employ.
La pluparts des enzymes sont mesures par des ractions
en cascades en UV mettant en jeu le couple NAD+/NADH2
qui sont facilement mesurables.
Ces techniques sont rapides, spcifiques et automatisables.
Cette mthode prsente en outre lavantage de pouvoir
vrifier que la vitesse est constante durant la mesure.
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Mthodes cintiques
Dans les mthodes cintiques enregistrement
continu, la dure de raction na pas besoin dtre
fixe avec rigueur .
La raction est dclenche, par addition dun
ractif (appel ractif dclenchant) ou par addition
de lenzyme, aprs avoir attendu que le milieu se
stabilise.
Elle volue et enregistrement de de la courbe :
P = f(t) permet la dtermination de lactivit sur
graphe.
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Cintique enzymatique en Ultra-violet


NAD ou NADP se lient rversiblement avec
lapoenzyme au cours de la raction, ils peuvent tre
considrs comme des co-substrat (raction 2 S):
AH2 + NAD+
AH2 + NADP+

A + NADH,H +
A + NADPH,H +

[NAD+ ] > 10 KmNAD+


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Cintique enzymatique en Ultra-Violet


NADH prsente deux bandes dabsorption : lune a
260nm, lautre a 340 nm;
NAD+, une seule a 260 nm.
Si la raction enzymatique volue dans le sens de la
rduction du NAD+ , la DO 340 nm augmente ;
inversement, si elle volue dans le sens doxydation
de NADH, la DO 340 nm diminue.
Le coefficient dextinction molaire du NADH ou
NADPH a 340 nm est : = 6300 mol.l-1cm-1
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Dosage en UV cintique de la LDH


Mesure

laugmentation
deA340nm

LDH

Mesurela

diminution
deA340nm

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NAD+ et NADH2 prsentent un pic


dabsorbtion
( surtout NAD+) a 260 nm
alors on mesure lectivement Le NADH2 a
340nm ( UV )

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Cintique enzymatique en Ultra


Violet
Condition : la V de R cte durant la mesure/
lobservation en continu de la variation de DO
permet de le vrifier chaque instant.
Dans un tube essai thermostat on introduit le
tampon (PH 7,5), lchantillon de LDH doser, le
NADH,H +.
Puis on ajoute le pyruvate (ractif dclenchant);
On observe la baisse rgulire de la DO.
La vitesse est cte tant que la courbe dcrit une
droite.
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Cintique enzymatique en Ultra-Violet


On calcule la variation de DO/min : lorsque la R est
dclenche, on mesure les DO toutes les min pendant 5 10
min.
Les DO/min doivent tre gales (ou trs proches)
indiquant que la R est linaire.
On calcule alors la DO/min moyenne.
AE = (DO/min) / 6,3 x VT /VE x 103 UI.l-1
VT et VE en cm3
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Cintique enzymatique en Ultra-Violet

DO =

Cl

DO1 = C1 l

C1 = DO1 / l

DO2 = C2 l

C2 = DO2 / l

C = C2 - C1 = (DO2 / l) - (DO1 / l)
= DO / l

AE= C/ min = DO /min / l


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Cintique enzymatique en Ultra-Violet

AE =

DO/min
.
l

VT

x 106

VE

A 340 nm
NADH,H + = 6300 mol-1. cm-1 .l.
AE en mol/min/l

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Ractions enzymatiques couples


Lorsque E, dont on mesure lactivit,
nest pas une dshydrognase NAD+ ou
NADP+ et que ni S et ni P ne possdent de
proprits spectrales, alors on couple la premire R
une deuxime, catalyse par une dshydrognase
dont P est le substrat.

E2

E1

P
NADH,H +

PH2
NAD+
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Ractions enzymatiques couples


La 1ere raction est dite R principale
La 2eme raction est dite R indicatrice

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Ractions enzymatiques couples


Exemple : dosage de lASAT
Ac aspartique + Ac -ctoglutarique
Ac
oxaloactique + Ac glutamique.
ASAT
AOA + NADH,H + MDH

Malate + NAD+

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Ractions enzymatiques couples


LAOA, produit de la 1ere R (principale) est le S
de la R indicatrice.
A chaque molcule dAOA apparaissant,
correspond loxydation dune mole de NADH,H + .
Dans ces conditions la variation de DO/min 340
nm correspond lactivit de la transaminase.

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Ractions enzymatiques couples


AE1 = AE2
Pour que la deuxime R soit indicatrice de la
premire, les conditions respecter sont :
1. La raction principale doit tre dordre 0
pendant la mesure (S de la 1ere R doivent tre
en large excs = V1 maximale et constante);
2. La R indicatrice doit tre dordre 1 par rapport
P qui devient S de la 2eme.
Dans ces conditions la R principale est limitante
pour la seconde
V1 = V2
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Etude de trois R couples


Lorsque P nest pas le S dune dshydrognase,
on couple la 1ere R une raction auxiliaire, ellemme couple une R indicatrice.
S

E1
V1

E2

E3

V2

V3
NADH,H +

R principale

R auxiliaire

XH2
NAD+

R indicatrice
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Etude de trois R couples


Exemple: dtermination de lactivit de la CK srique.
R principale:
Cratine-phosphate + ADP

CK

cratine + ATP

R auxiliaire:
ATP + glucose

hexokinase

glucose 6P + ADP

R indicatrice:
G6P + NADP+

G6P
Dshydrognase

NADPH,H+ + 6P gluconolactone

On suit lvolution de la R indicatrice par spectrophotomtrie


340 nm.
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Cintique enzymatique
colorimtrique
Exemple: Dosage des phosphatases alcalines (PAL)
p-nitrophnylphosphate

PAL

p-nitrophnol + phosphate

Le substrat = p-nitrophnylphosphate;
Le tampon = dithanolamine+ MgCl2;
Dosage colorimtrique directe du produit form (PNP) 405 nm :
enregistrement des DO des intervalles de temps rguliers (1 min).

AE = DO /min / l x VT /VE x 106 UI.l-1

PNP 405nm = 18000 M-1 . cm-1. l.


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