Universidad Central de Venezuela

Facultad de Medicina
Escuela de Medicina Luis Razetti
Ctedra de Bioqumica

Tema 4:
Estructura y Funcin de las
Protenas (4)
Prof. Vanessa Miguel
vanessa.miguel@ucv.ve
@bioquitips

Diciembre 2012

Cmo se estudian las

protenas?

Aislando fracciones
subcelulares

Mtodos de purificacin
Se basan en las propiedades fisicoqumicas de
las protenas:

Tamao
Solubilidad
Carga
Adsorcin
Afinidad

Caracterstica

Procedimientos
Dilisis ultrafiltracin
Electroforesis en gel
Cromatografa de exclusin molecular
Ultracentrifufacin

Tamao

Solubidad

Precipitacin con Sales

Solventes orgnicos

por pH

Polaridad

Carga
Selectividad

Cromatografia de absorcin
C. En papel
C. En fase reversa
C. De interaccion hidrofbica
Cromatografia de intercambio inico
Electroforesis
Isoelectroenfoque
Cromatografia de afinidad

Centrifugacin

Utiliza la fuerza centrfuga (fuerza-g) para aislar

partculas suspendidas.
Los componentes de la mezcla se separan por: peso,
tamao, densidad y forma.
Se utiliza para la separacin de organelos subcelulares y
para el aislamiento de macromolculas, tales como
ADN, ARN, protenas o lpidos
Se separan es su coeficiente de sedimentacin(s);
medido en Svedbergs (1 S = 10-13 segundos), depende
de la forma y el tamao de la molcula o partcula.

Centrifugacin

Centrifugacin en gradientes de densidad

Gradientes continuos de sacarosa tubo de
centrfuga

Aplicacin de fuerza centrfuga

Fundamento de la
cromatografa

Muestra:
tres componentes
mezclados

Fase
estacionaria

Se dispone una mezcla

sobre una fase estacionaria

Se hace fluir una fase

mvil sobre
la estacionaria

Fase mvil

Dependiendo de la
afinidad
relativa por ambas
fases, los
componentes de la
mezcla
se separan

Cromatografa

Exclusin molecular:
Separa segn tamao molecular
Fase estacionaria: dextrano o agarosa
entrecruzados
Fase mvil: solucin buffer
Intercambio inico:
Separa segn carga elctrica
Fase estacionaria: grupos cargados unidos a
un soporte insoluble
Fase mvil: gradiente de sal o de pH

Exclusin molecular

Separa mezclas de protenas por tamao

Las columnas rellenas de polmeros
inertes insolubles pero muy hidratados:
Sephadex: polimeros de dextrano
Sepharose: agarosa
Superose: agarosa entrecruzada
Sephacryl: dextrano-bisacrilamida
Superdex: agarosa y dextrano

Exclusin Molecular
Resina porosa
Fase estacionaria
Amortiguador
Fase mvil

Resina

A:
Pasa slo por fuera de las perlas
Menos recorrido, sale primero
B:
Pasa por dentro y por fuera de las perlas
Mayor recorrido, Sale despus

Exclusin molecular

Volumen de exclusin

Protenas de gran tamao no

penetran los poros
permaneciendo en el volumen
de exclusin de la columna Vo

Exclusin Molecular
1.La columna se equilibra con el buffer de corrida
2. Aplicacin de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna)
3. Elucin.
.

Cromatografa en columna

La salida de las protenas se detecta normalmente

por absorcin de la luz, en una longitud de onda de
280nm.
Los aminocidos de las protenas absorben tal luz y
se cuantifica utilizando un espectrofotmetro,
Los datos se registran en un diagrama de
elucin que indica la posicin de las protenas que
se han separado.
Despus pueden realizarse estudios de actividad
biolgica, enzimtica, etc. de las protenas
fraccionadas

V o lu m e n
G lu c a g o n

280

C it o c r o m o c

240
R ib o n u c le a s a

200

S e r o a lb m in a

160
120

Ig G

T ir o g lo b u lin a

80
40

10

10

10

10
P e s o m o le c u la r

B o m b a p e ris t ltic a

G e n e ra d o r
d e g ra d ie n te
C o lu m n a

C o le c t o r d e
f ra c c io n e s

R e s in a d e Cromatografa de
in te rc a m b iointercambio inico
i n ic o

 Un intercambiador inico consiste en una matriz

porosa con grupos cargados unidos
covalentemente.
Estos grupos se asocian con iones de la fase mvil
(contraines), estos pueden intercambiarse por
otros iones de las misma carga sin alterar la matriz.
La matriz generalmente es un compuesto
inorgnico, resinas sintticas o polisacridos.
Matriz

Nombre

Dextrano

Sephadex

Agarosa

Sepharose CL-6B

Celulosa

Sephacel

Intercambio Inico

Los grupos funcionales cargados son una

propiedad fundamental del intercambiador.
Determinan el tipo y la fuerza del
intercambiador
El nmero total y su disponibilidad,
determinan la capacidad del intercambiador
Los de carga negativa adsorben cationes
(intercambiadores catinicos) mientras que
los de carga positiva adsorben aniones
(intercambiadores aninicos)

Intercambiadores aninicos

Intercambiadores catinicos

Intercambio inico
Mecanismo de
separacin

Separa a molculas por

carga neta.

Grupos cargados unidos

a la matriz unen las
muestras de carga
opuesta(reversible)

La elucin se logra a
travs el cambio del pH
o aumentando la
concentracin de sal del
eluyente.

Fig 1.1. Charged sample molecules

adsorb to ion exchangers of the
opposite sign. The interaction is a
dynamic equilibrium that can be
influenced by pH or salt
concentration.

Cromatografa de
intercambio inico
A: (+) Retenidas por la resina

B: (-)

Resina carga (-)

Atrae cationes

Para separar A de la resina es

necesario cambiar el pH por arriba
del pI

Intercambio inico
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+

--

- - -

A baja concentracin
Protenas adsorbidas de sal, se desprenden
al intercambiador
las protenas menos
inico
electronegativas

+
+
+
+
+
+
+
+
+

- - - - - - - -

A mayor concentracin
de sal se desprenden
las protenas ms
electronegativas

Electroforesis

Mtodo de separacin de sustancias

cargadas al aplicar un campo elctrico, de
modo que se diferencian en el diferente
comportamiento en un campo elctrico.
Aquellas partculas cargadas positivamente
(cationes) migrarn hacia el ctodo y las
cargadas negativamente (aniones) hacia el
nodo.

Electroforesis

Muestra

1. Se realiza sobre un soporte

slido o semislido, para
minimizar efectos de difusin
2. Se somete el conjunto a
un campo elctrico constante,
a un pH fijo; las protenas migran
conforme a su carga elctrica

3. Terminada la electroforesis, las

protenas se tien con un
colorante adecuado (ej., Azul de
Coomassie)

Ctodo

+
nodo

Electroforesis de zona

Papel de filtro o acetato de celulosa

Revela la presencia de protenas con
colorantes especficos
No existe interaccin con el soporte
Resolucin muy baja
Rpido

Electroforesis en geles de poliacrilamida

Separa por carga y tamao

El material soporte interacciona con las
protenas actuando como matriz retardando
a las protenas ms grandes
Utiliza geles de poliacrilamidas.
Condicion nativa (PAGE) o
desnaturalizante(SDS-PAGE)

Electroforesis

SDS-Page
Las protenas se separan slo por su PM
El SDS interacciona con las protenas por
interacciones hidrofbicas
Recubre las protenas con carga negativa
proporcional a su PM
Desnaturaliza la estructura nativa de la
protena
-mercaptoetanol rompe los puentes
disulfuros

Electroforesis

Electroforesis bidimensional

Electroforesis: Aplicaciones
Separar protenas
de una mezcla
Determinacin de
PI y PM
Fraccionamiento
de las
hemoglobinas
Diferenciacin de
la hemoglobina
fetal
Diagnstico de
talasemias,
anemias

Protenas sricas
Protenas urinarias
Lipoprotenas
cidos nucleicos
Enzimas
Inmunoelectrofores
is
Etc.

Solubilidad

Muy utilizados en los primeros pasos de la

purificacin
Mantiene nativa a la proteina
Redisolucin sin prdida de actividad
Cada protena tiene una composicin de aa
diferente y diferente solubilidad

Solubilidad
Depende de:
pH
Fuerza inica
Disolvente
Temperatura

Solubilidad-pH
La carga neta de las protena depende del
contenido de aa cidos y de aa bsicos
Cuando el valor del pH donde la carga neta de
la protena es cero pI
Solubilidad es mnina
Ej: contenido de aa cidos pI bajo (4-5)

Solubilidad: disolventes

Adicin de disolventes neutros miscibles en

agua (ACETONA, ETANOL)
Se usan en distintas proporciones
Disminuyen la solvatacin de las protenas
en soluciones acuosas

Solubilidad-Fuerza inica

Salting in

Salting out

Salting in (salado)
Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001
0.02 M)
aumenta con la [ sales] Salting in

Al aumentar la [sales]
protena se rodea de contraiones
ms soluble por > interaccin protenasolvente

Salting out (precipitacin por salado)

La solubilidad a alta fuerza inica (mayor

a 0,02M) disminuye con la [sales]

Salting out
La alta [sal] remueve la esfera de
solvatacin de la protena y stas precipitan

Solubilidad- Temperatura

0-40 oC
>T > solubilidad.
40-50oC
aumenta la inestabilidad y
DESNATURALIZAN ( solubilidad)