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CUANTIFICACIN

DE ADN DE
ALTO PESO
MOLECULAR
CATEDRA : BIOLOGA MOLECULAR
DOCENTE: M.Sc. ELMER REN CHAVEZ
ARAUJO

MTODOS

Para la cuantificacin del ADN,


existen dos mtodos indirectos que
permiten estimar la concentracin
del ADN en las muestras
Por visualizacin
y mediante espectrofotmetro.

Estimacin de la
concentracin de ADN por
visualizacin.

El
mtodo
indirecto
ms
recomendable para la determinacin
de la concentracin de ADN en una
muestra es mediante la visualizacin
de un gel de electroforesis en el cual
se
colocan
muestras
con
concentraciones conocidas.

PROCEDIMIENTO

El procedimiento requiere la preparacin


de una cmara de electroforesis (se
recomienda la cmara mediana para 22
o 40 muestras), colocando cada una de
las muestras que se desea evaluar en
pozos individuales y dejando al menos 10
pozos libres.

ELECTROFORESIS

Posteriormente se inicia la electroforesis


con 6 v/cm y diez minutos antes de que
concluya la corrida, se detiene la fuente
de poder, se destapa la cmara de
electroforesis, sembrando las muestras
de concentraciones conocidas.

FASE FINAL

Finalmente
se
cierra
la
cmara
de
electroforesis, se enciende nuevamente la
fuente de poder, dejando que corra durante
10 minutos, se visualiza el producto con U.V. y
se toma una fotografa.
En este mtodo la estimacin se realiza
contrastando intensidades de luz entre las
muestras, lo cual se realiza visualmente o con
el auxilio de algn programa computacional
que contraste intensidades de color.

Espectrofotometra

La Espectrofotometra es una de las


tcnicas experimentales ms utilizadas
para la deteccin especfica de molculas.
Se
caracteriza
por
su
precisin,
sensibilidad y su aplicabilidad a molculas
de distinta naturaleza (contaminantes,
biomolculas, etc) y estado de agregacin
(slido, lquido, gas). Los fundamentos
fsico-qumicos de la espectrofotometra
son relativamente sencillos.

La absorcin de luz en el ultravioleta


cercano (325-420 nm) y en el visible
(420-900 nm).

A. Esquema de un espectrofotmetro de
un solo haz
B. Esquema de un espectrofotmetro de
doble haz.

Estimacin mediante
espectrofotmetro.

En este mtodo se utiliza un


espectrofotmetro que mida la
absorvancia a 260 nm y 280 nm. En
un equipo automatizado se sigue el
siguiente protocolo.
Encienda el espectrofotmetro al
menos 15 minutos antes de iniciar las
lecturas.

Muestras con suficiente pureza

Mide cantidad de irradiacin UV absorbida por las bases

Preparacin del blanco.

Agregue 10 ml de TE-RNasa (o la
solucin que utiliz para resuspender el
ADN de la muestra problema) y 990 m l
de
Agua
dd,
en
una
celda,
asegurndose
de
la
perfecta
homogeneizacin.
Coloque la celda en la posicin 1 del
espectrofotmetro.

Preparacin de las
muestras.

Agregue 10 m l de la muestra
problema y 990 m l de Agua .dd, en
otra celda, asegurndose de la
perfecta homogeneizacin.

Lectura.

Para la lectura solo se tiene que responder


con el teclado del equipo las preguntas que
aparecen en pantalla. El equipo permite
evaluar la concentracin de protenas
(limpieza de la muestra), presencia de ARN y
concentracin de oligos (ADN degradado).
Es importante aclarar que la relacin
A260/A280nm no es lineal, por lo que puede
llevar a lecturas errneas, recomendndose
solo como mtodo complementario de
evaluacin.

Lectura a 260 nm
Mide concentracin ADN muestra
50 ug/ml--------------1 O.D

Conc.ADN (ug /ml) = valor O.D x factor diluci

Lectura a 280 nm:


Mide contaminacin (pureza muestra)

Tasa absorbancia: 260/280


Ej. 1.8- 2.0 (ADN puro)
< 1.8 o > 1.8 (muestra
contaminada, Ej: protenas,
ARN)