CULTIVO DE TEJIDOS

VEGETALES

 El

trmino

vegetales

cultivo
involucra

de

tejidos

diferentes

tcnicas de cultivo, de material

vegetal

Esquema de Tcnicas de cultivo de tejidos vegetales

en plantas superiores
Cultivo de semillas
Cultivo de embriones

Cultivo de
meristemas

Cultivo de tejidos vegetales de plantas superiores

Cultivo de clulas,
callos, explantos y
pices

Cultivo de
protoplastos

Cultivo de
microesporas
y anteras

 Mediante el cultivo de tejidos, es posible

obtener plantas libres de patgenos en un
medio nutritivo, asptico y en condiciones
ambientales controladas.

Esta tcnica tiene numerosas aplicaciones,

entre otras:

Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales de las

plantas superiores
Propagacin masiva de
plantas alimenticias

Preservacin de
germoplasma in vitro

Obtencin de plantas
libres de virus

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Recuperacin de plantas
en peligro de extincin

Regeneracin de plantas
potencialmente tiles
Induccin de
variabilidad
gentica in vitro

Algunas aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas

Recuperacin de
plantas en peligro
de extincin
Obtencin de
plantas libres de
virus

Micropropagacin
o propagacin
masiva de plantas

Mejoramiento
gentico de
plantas

Cultivo de
Tejidos
vegetales

Preservacin de
germoplasma in
vitro

Algunas aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas

Micropropagacin
Violeta africana trozos de hojas
desinfectados
introducidos en condiciones de esterilidad.

Semillas sintticas
Embriones somticos cultivo de
clulas
encapsulados en una matriz inerte (alginato de
calcio).

 Existen

tres

conceptos

bsicos

que

fundamentan el cultivo in vitro de clulas y

tejidos vegetales:

Totipotencialidad celular: toda clula vegetal individual

es capaz de regenerar una planta entera a partir de un
cultivo in vitro, sin importar el grado de diferenciacin
alcanzado.

Para

esto

se

requieren

condiciones

especficas referidas al medio del cultivo, relaciones

hormonales, temperatura, fotoperodo, etc.

Desdiferenciacin / Rediferenciacin: es en la prdida

de las caractersticas de especializacin de un tipo
celular para dar lugar a clulas de tipo meristemtico y
posteriormente la rediferenciacin de estas clulas
previamente desdiferenciadas.

Balance

hormonal: el proceso de diferenciacin est

regulado por el balance entre diferentes tipos de

reguladores del crecimiento, fundamentalmente de
auxinas y citoquininas.

BALANCE HORMONAL
AUXINA: CITOQUININAS = ~1
Induce formacin de Callo
AUXINA: CITOQUININAS > 1
Induce formacin de Races

: CITOQUININAS< 1
Induce formacin de Tallo
AUXINA

 Las clulas vegetales crecidas en

condiciones aspticas, sobre medios de
cultivo

que

contienen

hormonas

vegetales, pueden dividirse dando dos

tipos de Morfognesis:

Morfognesis
La morfognesis es la formacin de rganos y
comprende el crecimiento y la diferenciacin
celular y puede seguirdos rutas alternativas:
La Organognesis: en la cual se produce la formacin
de rganos (tallos, races u otras estructuras)
La Embriognesis: en la que se forman embriones que
al germinar dan lugar a una planta.

 En ambos casos, el proceso se genera a partir

de clulas somticas.
Si

la

primera

respuesta

al

estmulo

morfogentico es la formacin de callo, antes de

diferenciarse en meristemas o embriones, se
habla de organognesis y de embriognesis
indirecta.

 La organognesis es una de las vas en la cual se

diferencian meristemas a partir de las clulas o
tejidos cultivados.
Cuando se produce un meristema apical su
desarrollo da lugar a una planta.
En este proceso la produccin de tallos y races es
independiente.

 La embriognesis es un proceso por el cual se

generan embriones a partir de clulas somticas en
cultivo.
Estos embriones somticos siguen las mismas etapas
de desarrollo que los embriones cigticos pero no son el
resultado de la fecundacin de gametos.
Estos embriones germinan igual que una semilla dando
origen a un tallo y una radcula simultneamente.

 Organognesis

directa:

Consiste

en

la

generacin de plantas sin races directamente

del explanto.
Esta ruta generalmente se sigue cuando se
usan

meristemas

laterales.

vegetativos

terminales

Organognesis directa Violeta Africana

A. zona del explanto donde se est

produciendo la brotacin de yemas
adventicias

B. Detalle de los nuevos brotes que se

estn formando en el borde del
explanto

C. Aspecto del explanto una vez

sacado del tubo de cultivo

D.
plantas
obtenidas
por
micropropagacin, listas para aclimatar

 Embriognesis directa: Los embriones se

forman directamente a partir de los explantos
sin formacin de callos

Embriognesis directa
PLANTA DE AJ
Cultivo de anteras y regeneracin
de plantas haploides
a) Antera al inicio del cultivo
b) Antera con 6 das de cultivo.
c) Embrin emergiendo de la
antera con 30 das en cultivo
mostrando races
d) Embrin mostrando races y
brotes.
e) Plntula con cotiledones
f) Plntula con hojas
g) Subcultivo en un medio de
crecimiento.
h) planta haploide regenerada a
80 das de cultivo .

 Organognesis

indirecta:

Los

embriones

se

desarrollan a partir de callos desarrollados del

explanto y a partir de ste se forman partes
vegetativas diferenciadas como brotes o races,
de las cuales se obtiene la plntula segn sea la
especie y las hormonas usadas.
Este es el caso principalmente del cultivo de
protoplastos.

Organognesis indirecta

Seccin
Entrenudo

Induccin callo
organognico
Induccin brote
Induccin raz

 Embriognesis indirecta: El explanto genera

la formacin de un callo, a partir de ste se
forman embriones somticos, de los que se
obtienen plntulas segn sea la especie y las
hormonas usadas.
Este es el caso de secciones de tallo, hoja o
raz y protoplastos.

Embriognesis indirecta

Seccin
entrenudo
Establecimiento e
induccin de callo
Mantencin y
embriognico
multiplicacin

1. Desarrollo
2. Maduracin y
3. Germinacin
embriones

MICROPROPAGACION

Micropropagacin
Mtodo de propagar plantas usando
partes muy pequeas de sta (explantos),
que se desarrollan en cultivos estriles (in
vitro).
Se usa en la produccin de especies
hortcolas,

aromticas,

medicinales,

frutcolas, ornamentales y forestales.

Ventajas Micropropagacin / mtodos convencionales

Multiplicacin acelerada del nmero de plantas,
Menor tiempo de multiplicacin,
Produccin

permanente

de

material

(no

hay

estacionalidad),
Mayor cantidad de plantas en una superficie pequea (en
tiempos y costos econmicamente viables),
Mayor control sobre la sanidad del material propagado,
Mayor Facilidad para el transporte del material in vitro,

Desventajas Micropropagacin / mtodos convencionales

Instalaciones muy especializadas
Personal especializado
Contaminacin
Protocolos no estandarizados
Menor tamao de las plntulas
Transicin heterotrofa/autotrofa
Costos: produccin a gran escala

 El cultivo in vitro exige un control absoluto

del ambiente, tanto qumico como fsico,
en el que se sita al explanto.
AMBIENTE QUMICO
Medio de Cultivo
pH

AMBIENTE FSICO
Temperatura
Luz

AMBIENTE QUIMICO

Medio de cultivo
Se agrupan en medios slidos, semislidos y
lquidos.

Conjunto de elementos que integran la sustancia

nutritiva que da anclaje, nutricin y estimulacin al
desarrollo del explanto, ya que los explantos no
son autotrficos

 MEDIOS DE CULTIVOS
El medio de cultivo es el sustrato en el cual se
desarrollan los rganos , clulas y tejidos despus
de ser aislados de la planta madre

Slidos o Semislidos
Segn la concentracin del soporte
llevan diferentes componentes que
tienden a solidificar y mantener el
medio solidificado en la superficie,
como el agar que se usa en de 0,3 a
1% de concentracion.

Lquidos
Se puede usar como soporte
papel filtro o perlas de cristal

Medio Slido (Agar)

Medio Lquido

Composicin
Medios de Cultivos

Se han desarrollado muchas

formulaciones para

los medios de cultivo (Medio Basal), que se

diferencian en las cantidades y tipos de sales
usadas.

 Los ingredientes del medio de cultivo varan

segn el tipo de planta y la etapa de propagacin
en que se est trabajando.
Estos ingredientes se agrupan en:
a) Sales Inorgnicas
b) Compuestos Orgnicos
c) Ingredientes naturales complejos
d) Soportes Inertes

a) Sales Inorgnicas:
Aportan:
macronutrientes (N, K, P, Ca, Mg y S) y
micronutrientes (Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Co, I,)
Requeridos para el desarrollo normal de
cualquier planta

b)Compuestos Orgnicos:
Carbohidratos:

Como

el

explanto

no

puede

fotosintetizar, se usan como fuente de energa,

principalmente sacarosa. Se pueden emplear otras
como, glucosa, fructosa, lactosa.
Vitaminas: Son compuestos que normalmente la
planta necesita para completar su desarrollo, las que
ms se incluyen en la preparacin de medios son:
Tiamina, cido Nicotnico, Piroxidina.

 Hormonas y Reguladores de crecimiento: las

dos ms importantes que se usan son auxinas y
citoquininas, que controlan la formacin de raz,
tallo y formacin de callo.
Auxinas: Relacionadas con la formacin de callo y la
divisin celular. (0.01 a 10 mg/l) Se disuelven enNaOH
1N.
Acido indol actico (AIA) (natural);
Acido dicloro fenoxiactico (2,4-D) (sinttica),
Acido indol butrico (AIB) (sinttica),
Acido Naftalen actico (ANA) (sinttica).

Citoquininas: Relacionadas con la formacin

primaria de los rganos y embriones y

la

divisin celular. (0.03 a 10 mg/l). Se disuelven

en HCl 1N.
Zeatina (natural),
Kinetina (sinttica),
isopentil adenina (IPA) (sinttica),
Bencil adenina (BA) (sintticas).

Auxinas

Citoquininas Auxinas

Parte area

Citoquininas

Enraizamiento

c) Ingredientes naturales complejos:

Existen un tipo variado de compuestos que se incorporan
a los medios de cultivo cuando no se ha logrado
resultados con sustancias conocidas. Los principales son:
Leche de coco(5-15% v/v)
Antioxidantes ( cido ctrico, cido ascrbico)
Aminocidos ( Sulfato de Adenina (2-120 ppm), glicina, asparraguina,
cistena, tirosina, glutamina,etc.)
Carbn activado ( 0.1-5%)
Casena hidrolizada(0.1-1%)
Jugos de frutas
Extractos de papa o levadura.
Purinas y Pirimidinas.

d)Soportes Inertes:
Son el medio de soporte de los tejidos u

rganos que se siembran, reemplazan el suelo

que es el sustrato natural, los ms empleados
son el agar (5 a 6 g/L) y tambin se ha usado
pectinas comerciales (8 a 10 g/L).

 pH
Cuando se prepara un medio de cultivo, se debe
ajustar el pH final al valor deseado, y una vez
ajustado el pH, se esteriliza.
En general se trabaja con valores entre 5.0 y 6.0,
pero para plantas acidfilas es mejor un pH 4.5
Un pH < a 3.5 impiden la solidificacin de los
agentes gelificantes.

 El valor del pH puede afectar:

La solubilidad de algunos componentes del
medio de cultivo
La absorcin de determinados nutrientes por
parte del explante (p.e. la absorcin de iones
NO3- aumenta con la acidez del medio)
El pH del citoplasma y como consecuencia la
actividad de muchas enzimas

AMBIENTE FSICO
TEMPERATURA
La temperatura afecta el crecimiento del cultivo y
es un factor que induce determinados procesos
fisiolgicos.
En general temperaturas de 21 a 30C son
adecuadas,

aunque

algunas

plantas

necesitar temperaturas ms bajas.

pueden

 LUZ
Los aspectos relacionados con la luz que
son importantes son:
a. LA IRRADIACIN: La cantidad de luz
b. EL ESPECTRO: La calidad de la luz
c. EL FOTOPERODO: La alternancia de los
ciclos de luz y oscuridad

a. IRRADIACIN:
. Cantidad de luz que incide sobre las superficies
fotosintticas de las plantas y determina en gran medida
la capacidad fotosinttica de ellas.
. Los cultivos in vitro necesitan menos luz porque el medio
de cultivo contiene cantidades importantes de sacarosa.
. Adems, una irradiacin excesiva puede producir un
aumento de la temperatura dentro del recipiente de
cultivo debido al efecto invernadero.

 La

irradiacin

habitual

en

campo

(a

plena

insolacin puede llegar a 450 W/m 2) es nociva en

condiciones in vitro.
In vitro es habitual usar irradiaciones mucho
menores (un 10% o incluso menos del valor de
plena insolacin)

b. ESPECTRO: (calidad de la luz)

. En la fotosntesis se capta la energa contenida en
diferentes radiaciones para incorporarla a las diversas
reacciones qumicas que constituyen el proceso.

. La cmara de cultivo debe reproducir lo mejor posible

el espectro de luz activo, por lo tanto conviene
conocer cual es el espectro que emiten las fuentes de
luz y en que medida se adapta ste a las necesidades
del cultivo.

c. FOTOPERIODO:
. La germinacin, floracin, tuberizacin,... entre
otros, se activan por el n de horas diarias de luz
que reciben las plantas.
. Tambien, el nmero de horas de luz que recibe el
explanto cultivado in vitro puede afectar a su
desarrollo.
. En general, se usa un fotoperiodo de 16 horas.

Etapas dentro del proceso de

micropropagacin
0: Seleccin y Preparacin de la planta madre.
1: Desinfeccin del material vegetal.
2: Introduccin del material seleccionado in vitro.
3: Multiplicacin de brotes.
4: Enraizamiento.
5: Aclimatacin

Etapa 0:
PREPARACIN DE LA PLANTA MADRE
Se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un
grado de desarrollo adecuado.
Para esto es recomendable mantener a las plantas madre un
perodo de tiempo que puede ser entre unas semanas o
varios meses, en un invernadero, en condiciones sanitarias
ptimas, bajo condiciones controladas.

 Recomendable que crezca en invernadero o cmara de crecimiento

Usar material homogneo
Elegir plantas vigorosas
Promover nuevas brotaciones con podas severas
En maceta con sustrato estril
Programa sanitario

 Las plantas madres influyen en la capacidad

regenerativa del explanto obtenido de ellas debido a:
Genotipo: Dicotiledneas mejor que monocotiledneas, y entre
ellas las Solanceas y crucferas son de muy fcil
regeneracin.
Edad: Partes juveniles mejor que las adultas
Estado del rgano o tejido: Mejor no leosos
Estado fisiolgico: Partes vegetativas mejor que partes
generativas

 Estado sanitario: Las ms saludables y vigorosas son

mejores
Condiciones de crecimiento: diferente respuesta si crece en
campo que en invernadero
Tamao del explanto: En general a mayor tamao mayor
capacidad regenerativa

Etapa 1:
DESINFECCIN DEL MATERIAL VEGETAL
Se extraen los fragmentos de la planta madre a partir de los
cuales se obtendrn los explantos (yemas, trozos de hojas,
porciones de races, semillas, etc).
Se hace una desinfeccin de los fragmentos, con soluciones
desinfectantes (etanol-hipoclorito de sodio), para eliminar
contaminantes externos y poder extraer los explantos.

 Se trabaja en cmaras de flujo laminar en condiciones

de asepsia para extraer los explantos a partir del
material vegetal.

Estos explantos se introducen en un tubo de cultivo que

contenga un medio de iniciacin para poder controlar la
sanidad y la viabilidad.

Esquema de la etapa 1 del proceso de micropropagacin

Fragmento

Explantos

Planta
Madre

Segmentos uninodales

Etapa 2:
INTRODUCCIN DEL MATERIAL IN VITRO
Los explantos, se ponen en un medio de cultivo estril.

En 7 a 15 das, comienza el proceso de germinacin o

regeneracin de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo
de cultivo in vitro.

Etapa 3:
MULTIPLICACIN DE LOS BROTES
En esta fase los explantos originan brotes con varias hojas.
En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollar si
se pone en contacto con el medio de cultivo.
Peridicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en
un nuevo medio, mediante divisiones y resiembras en
condiciones de asepsia.

Esquema del proceso de multiplicacin de los brotes

Brote de Explanto

Divisin del Brote

Siembra y resiembra de
brotes

Etapa 4:
ELECCIN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS
EXPLANTOS
Para enraizar los explantos se utilizan
principalmente dos mtodos:
Enraizamiento in vitro
Enraizamiento ex vitro

Embrin Germinado
In Vitro
Enraizamiento
in vitro

Enraizamiento
ex vitro

 ENRAIZAMIENTO IN VITRO
En la cmara de flujo laminar, se transfieren los
explantos a un medio que solo contenga auxinas.
Este mtodo permite ms flexibilidad para escoger
los brotes, ya que stos obtienen del medio de
cultivo la fuente de energa para enraizar, y por
tanto no es necesario que tengan las hojas muy
bien desarrolladas para realizar la fotosntesis.

 ENRAIZAMIENTO EX VITRO
Los explantos se transfirieren a un sustrato
limpio, que puede ser una mezcla de turba con
perlita o vermiculita.
El medio de enraizamiento debe estar libre de
patgenos y los brotes deben tener las hojas bien
desarrolladas, ya que deben realizar fotosntesis,
para tener energa para enraizar y desarrollarse.

 Los explantos se plantan en contenedores

cubiertos por un plstico, para mantener la
humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar
en el laboratorio, o dentro de un invernadero
en un rea sombreada y con "mist-system".

fase de enraizado ex vitro.

Fotografa de un cultivo en la fase de enraizado ex vitro.

Etapa V:
ACLIMATACIN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS
Los explantos son muy sensibles a los cambios
ambientales, por lo que el xito o el fracaso de todo
el proceso depende de la aclimatacin.
Los explantos enraizados in vitro estn poco
adaptados a crecer en invernadero porque sus
estomas no son completamente funcionales, adems
de la falta de una cutcula con cera bien desarrollada
para evitar la perdida de agua.

 Los explantos deben ser aclimatados a las condiciones

de humedad del invernadero disminuyendo en forma
progresiva

la

humedad

relativa

aumentando

progresivamente la intensidad de luz.

Estos explantos se llevan a contenedores cubierto con
un plstico para mantener una lata humedad relativa.
Para trasplantar, se elige un sustrato suelto, poroso,
con mezcla de arena y turba, para lograr un desarrollo
y crecimiento rpido de races.

Aclimatacin en contenedores cubierto con plstico

 Se debe controlar la humedad, para mantener

un ambiente hmedo a nivel del sustrato.
A los 15 das del trasplante, se puede
comenzar a levantar la cobertura de nylon en
las horas de menor calor.

Planta entera

Microtnel

Esquema del proceso de aclimatacin ex vitro

 Los cambios deben ser muy graduales para

minimizar el estrs y tener mayor tasa de
sobrevivencia, ya que las condiciones del
cultivo in vitro, genera cambios en algunos
aspectos anatmicos y fisiolgicos de las
plantas como estomas no completamente
funcionales, y falta de cutcula con cera bien
desarrollada para evitar perdida de agua.

Comparacin de las caractersticas de una

planta in vitro respecto a una planta in vivo
Planta In vitro

Planta In vivo

No realiza fotosntesis

Realiza fotosntesis

Crecimiento en condiciones

Crecimiento en condiciones no

controladas

controladas

Crecimiento en condiciones de

Exposicin a patgenos y

asepsia

grmenes del ambiente

Alta humedad relativa

Humedad relativa variable

Estomas no funcionales

Estomas funcionales

Ausencia de pelos radiculares

Presencia de pelos radiculares

Ausencia de cera en la cutcula

Presencia de cera en la cutcula

Propagacin in vitro de vid variedad Red Globe

Explante de yema axilar

Brotes de vid que muestran

Plntula de vid aclimatada al

mostrando nuevos brotes

las races inducidas por el

sustrato en condiciones de

en la axila de cada hoja,

cido indolactico

invernadero, funcionando su

60 das despus de su
cultivo in vitro

actividad auttrofa