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CRECIMIENTO MICROBIANO
DEFINICIONES
La inhibicin y destruccin de microorganismos, hace
posible el uso de tcnicas aspticas en investigacin
microbiolgica, preservacin de alimentos, el control de
procesos industriales y la prevencin de enfermedades.
Los agentes antimicrobianos son utilizados para destruir o
impedir el crecimiento de los microorganismos.
Celula viable. Es aquella que es capaz de reproducirse y
formar colonias.
Muerte microbiana. El nico criterio vlido de muerte
microbiana es su prdida irreversible de la capacidad de
reproduccin.
Desinfeccin: Reduccin del nmero de microorganismos
en un ambiente inanimado
Esterilizacin. Eliminacin de toda forma de vida.
Asepsia: Inhibicin o destruccin de m.o. en la superficie
de un tejido vivo.
(1)
Donde:
N es el nmero de microorganismos viables en cualquiera
de sus formas, (clulas/mL),
kd es la constante cintica de muerte trmica.
Grficos de supervivencia
Representando log(N/No)
frente al tiempo para un
microorganismo determinado
se obtiene una recta de
pendiente negativa de valor
kd/2,3.
Esta representacin recibe el
nombre de grfico de
supervivencia.
Para cada temperatura se
obtendr una pendiente
diferente y por lo tanto un
grafico de supervivencia
diferente ya que kd vara con
la temperatura.
Una menor
poblacin, implica que
el numero de clulas
llegue mas rpido a
valores cercanos a
cero.
3,48
3,7
6
96
3,
mg/
l
mg
/l
l
g/
m
l
mg/
4,25
4,62 mg/l
6,04 mg/l
Logaritmo de los
supervivientes por ml
Tiempo (minutos)
Efecto de diferentes concentraciones de fenol sobre una poblacin de
E.coli.
Mayor concentracin requiere menor tiempo de accin del agente
100
50 C
10
70 C
60 C
tiempo
Cada especie microbiana tiene una respuesta diferente frente a los agentes
antimicrobianos, pero adems dentro de cada especie son importantes:
Estado fisiolgico de las clulas: las clulas jvenes son ms vulnerables
que las viejas.
Tipo de microorganismo: las clulas vegetativas en desarrollo son mucho
ms susceptibles que las esporas
SISTEMAS DE CONTROL
a.- Segn el mecanismo de
accin
Microbiocidas. Producen la
muerte de los microorganismos,
por:
Alteracin de permeabilidad de
membrana.
Alteracin de protenas y cidos
nucledos
Microbiostticos. Inhiben el
crecimiento celular. Aunque no
produce la muerte a un
microorganismo, impide su
reproduccin; la clula envejece
y muere sin dejar descendencia.
1. TRATAMIENTOS SEGUN EL
MTODO:
AGENTES FSICOS
Calor
Frio
Radiaciones
Filtracin
Desecacin
1.1. El calor
Es simple, barato y efectivo. El mejor mtodo en material
no termolabil.
Ventaja: penetra a travs del objeto.
Desventaja:
No es selectivo, por lo que en el tratamiento de alimentos,
puede producir prdidas del valor nutricional y sensorial del
alimento. (Alvarado et al)
E / RT
Energa de
activacin
c.2.- valor
(Dt)
D = -1
pend.
D =t - to
log No- log N
Ejemplo.1
Determinar el valor D116 de un m. o. que sometido a la
accin del calor arroja los siguientes datos de conteo:
Tiempo (min)
N viables (X)
340
10
65
15
19
20
4.5
25
1.3
Log X
340
2.5315
10
65
1.8129
15
19
1.2787
20
4.5
0.6532
25
1.3
0.1139
logX
Y.est
2.5315
2.477
10
1.8129
1.8775
15
1.2787
1.278
20
0.6532
0.6785
25
0.1139
0.079
.
D=17.2-8.5
D116 = 8.7 minutos
Mtodo analtico
D = (t1 t2)
Log (Xo/Xi)
Con los datos de la ltima tabla.
(tiempo de 10 a 20 min)
D116 = (20- 10)
(1.8775- 0.6785)
D116 = 8.63 minutos
A la T de 116C, y en las condiciones de ensayo, la
poblacin del m.o. disminuye a la decima parte cada
8.63 min.
que calentarlo
de esporas de
calentamiento
D.
Ejemplo:
Se desea aplicar tratamiento termico durante el
tiempo suficiente para reducir una poblacin de 10 12
esporas de C. botulinum a 100 (una espora); en
consecuencia, haya muy pocas posibilidades de que las
latas contengan una espora viable.
El valor D para estas esporas es de 0.204
minutos, a 121 C. (en 0.204 min baja de 10 12 a 1011).
CALCULO DEL TIEMPO.
Sern necesarios 12D= 12*0,204 = 2,04 min para
reducir 1012 esporas hasta una espora, calentando a
121C.
Ejercicios .
1.- Hallar el tiempo de reduccion decimal para una
muestra, cuya poblacin bacteriana muestra los siguientes
datos de supervivencia, a 110 C:
T (min):
0
5
10 20 30 40 50 60
X (cel/ml): 2000 1100 750 275 90 32 11
4
2.- El valor de D120 para un m.o es de 3 minutos, si
tenemos una contaminacin inicial de 8x1012 cel/gr Qu
valor de contaminacin tendr la muestra despus de un
tratamiento trmico a 120C por 18 min?
Rpta. 8x106 cel/gr.
c.3.- Valor Z
Constante de resistencia trmica (Z). Nmero de grados
centgrados que debe aumentar la temperatura para que el
valor D disminuya a la dcima parte.
Cambio de temperatura necesario para reducir 10 veces (una
unidad logartmica) el valor D. (Depende de K. y del medio)
T2-T1
Z= - log D -log D
2
1
Ejemplo: Z = 20C
Un tratamiento de 5 min.
a 100C equivale a 0,5
min a 120C
Ejemplo.3
Para un m.o. determinado, el valor D104.4 es de 113 min y el
D121.1 es de 2.3 min. Calcule su constante de resistencia
trmica.
DATOS: D104.4 = 113 min (DT1), D121.1 = 2.3 min(DT2), Z =?
T2-T1
Z= - log D -log D
2
1
SOLUCION:
reemplazando: Z = (121.1-104.4)/log(113/2.3)
Z = 16.7/1.69235
Z = 9.9 C.
Cada vez que se incrementa la T de termodestruccin en
9.9C, el valor DT se reduce a la decima parte.
Sustrato
Solucin amortiguadora de
fosfato
Medio de cultivo
Pollo a la king
Pollo a la king
Pavo relleno
NaCI al 0.5%
Valor D (C)
en minutos
Valor
z (C)
D121 = 0.204
D90 = 3-5
10
6-8
D60 = 0.39
0.40
D90 = 5.17
5.37
D90 = 15.4
D90 = 2.0-2.5
4.95.1
5.25.8
6.8
5.6
Los valores se han tomado de LF Bryan, 1979, Processes that Affect Survival
and Growth of Microorganismos, Time Temperature Control of Foodborne
pathogens, 1979.
Ejemplo 4
Calcular el valor Fo para el tratamiento de una conserva
destinada a reducir en un factor de 1012 el riesgo de
presencia de esporas de Clostridium botulinum, si se
conoce que tiene un D121.1= 0,21 min.
DATOS: Xo/Xf = 1012., D121.1 = 0,21 min.
SOLUCION:
Reemplazando se tiene:
F = 0,21log(1012)
Fo = 2,52 min
Para reducir en 12 ordenes de magnitud el nmero de
m.o. a 121,1 C se debe aplicar un tiempo de 2,52 min.
Ejercicio.
Se somete un producto a una esterilizacin trmica en
escalones segn la siguiente tabla:
Determinar:
a) Z, D121.1, Ea, K0
b) N al final de cada etapa de temperatura constante
c) Valores de L y n de todo el tratamiento trmico
Datos:
El microorganismo ms termorresistente presenta: D110
= 19.26 min; D125 = 0.15 min y N0 = 2.5106 ufc/g.
Ejemplo.
Se desea esterilizar conservas en envases de 125 ml
a 115 oC, se sabe que se pueden encontrar tres tipos
de microorganismos patgenos, cuyos datos de
termorresistencia son:
a) microorganismo ms resistente.
El microorganismo ms termorresistente a 115oC, es
aquel que tiene el mayor tiempo de reduccin decimal a
dicha temperatura.
Se calcula el tiempo de reduccin decimal a esa
temperatura (115 oC):
Usando esta frmula se puede construir la siguiente
tabla:
Microorganismo D121 (min) z (oC) D115 (min)
El microorganismo ms termorresistente es el B.
Ejercicios
1.- Si se ha determinado que para esporas de Clostridium
botulinum suspendidas en buffer fosfato el D121 = 0.204 min,
Cunto tiempo llevara reducir una poblacin de 10 12 esporas
de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 121C?
2.- Para el mismo sistema se sabe que el valor Z= 10C.
Cunto tiempo llevara reducir una poblacin de 10 12 esporas
de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 111C?
3.- La leche cruda a la entrada de la planta de procesamiento
tiene una carga bacteriana de 4x10 5ufc/ml. La leche se va a
procesar a 79C por 10 segundos. Si el valor D promedio para
la poblacin bacteriana a 65C es de 21 segundos y el valor Z
es de 9 C, cuntos microorganismos quedarn luego del
tratamiento a 79C?Cunto tiempo se requerira para lograr
el mismo grado de letalidad a 65C?Cunto tiempo llevara
reducir la concentracin a 1ufc/100ml con un tratamiento a
65C?
d.1.- Pasteurizacin
Es el proceso trmico realizado a lquidos (generalmente
alimentos) con el objeto de reducir los agentes patgenos que
puedan contener.
TIPOS:
LHT, (Low hot temperature). 30 minutos a 63C
HTST, (High temperature short time). 15 segundos a 72C
UHT , 140C-150C durante 1 seg.
Destruye patgenos (Coxiella burnetti, Mycobacterium
tuberculosis) y reduce flora de deterioro. En leche:
Mycobacterium tuberculosis , se destruye en 15 minutos a 60 C.
Coxiella burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a
veces en la leche, es ms resistente al calor que Mycobacterium
tuberculosis por lo que la pasteurizacin de la leche se realiza:
A 62,8 C durante 30 minutos
A 71,7 C durante 15 segundos
d.2.- Tyndalizacin
Proceso discontinuo con perodos de incubacin intercalados
Es un sistema de tratamiento a presin atmosfrica.
Calentamiento: 50-100 C por 30 min., e incubacin a 37C
por 24 Hr. 3 das sucesivos
En los intervalos de incubacin se produce la germinacin de
esporas supervivientes antes de ser sometidas a un nuevo
ciclo.
En cada nuevo ciclo se destruyen las nuevas formas
vegetativas formadas.
Usos: esterilizacin de productos de baja resistencia trmica,
cuando no existe otra opcin
d.3.- Esterilizacin
Condiciones :
121C durante 15 minutos, con cargas iniciales
bajas
121C durante 30 minutos, con cargas iniciales
altas
Aplicacin industrial
Debido a la cintica de primer orden que sigue la inactivacin microbiana es
prcticamente imposible la obtencin de un producto estril. La
destruccin completa de formas viables, representara la destruccin del
alimento. Los tratamientos trmicos adems de inactivar
microorganismos, tambin destruyen algunas vitaminas termolbiles
(Tiamina) y promueven la oxidacin de lpidos.
d.3.- Horno :
La esterilizacin seca se logra a 170 C por 2-3 hrs.
Se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio
y otros materiales slidos estables al calor.
Para el material de vidrio de laboratorio se consideran
suficientes dos horas de exposicin a 160 C.
d.4.- Incineracin:
La destruccin de los microorganismos por combustin o
cremacin.
En los laboratorios, las asas de siembra se calientan a la
llama de mecheros Bunsen.
La incineracin se utiliza industrialmente en la eliminacin
de residuos hospitalarios.
1.2. Frio
- Refrigeracion: 0- 8 C
Tratamiento microbiosttico. La baja T, por si misma no mata
los m.o., solo limita su desarrollo.
En general, el metabolismo de las bacterias se inhibe a
temperaturas por debajo de 0 C.
Casos especiales:
Choque fro.
Se somete un cultivo en crecimiento, a un enfriamiento rpido y
repentino; muchos m.o morirn inmediatamente.
Congelacion (menos de 0 C)
Las levaduras pueden explotar por la formacin de cristales
Las bacterias, son tan pequeas que no se pueden formar
cristales de hielo en su interior, por esta razn no mueren.
La congelacin es ms daina cuando se realiza lentamente;
los cristales de hielo que se forman y crecen, rompen la
estructura celular.
1.3. Radiaciones
Baja energa
Alta energa
Dos tipos: Radiaciones - ionizantes
- no ionizantes
Dinococcus radiodurans
1.4.- La filtracin
Los m.o, mas no los virus, pueden
ser eliminados.
Uso para materiales termolbiles
y sensibles a radiaciones. Para
tratar soluciones de vitaminas,
antibiticos y otras sustancias,
termolabiles.
Desinfeccin y esterilizacin
(membranas con 0.22 m)
Materiales:
nylon,
acero
inoxidable, steres de celulosa.
Los m.o quedan retenidos en
parte por el pequeo tamao de
los poros del filtro y en parte por
adsorcin a las paredes del poro
durante su paso a travs del filtro
debido a la carga elctrica del filtro
y de los microorganismos.
Son difciles de utilizar en lquidos
con muchos slidos suspendido
1.5.- La desecacin
La desecacin, puede ser por evaporacin o sublimacin.
Se usa en industria de alimentos.
La liofilizacin, elimina el agua mediante sublimacin.
La sublimacin evita los daos qumicos causados por el
secado con calor, y disminuye la actividad del agua aw.
Sin embargo, es un mtodo caro y tiene un uso industrial
limitado.
Coeficiente fenlico
Es un valor experimental para calificar a las sustancias
biocidas, tomando como referencia la capacidad biocida del fenol.
El mtodo estandarizado para obtener el valor del coeficiente
fenlico, consiste en una serie de tubos conteniendo cada uno 5
ml de diferentes diluciones del desinfectante.
A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan
diferentes diluciones de fenol. Cada tubo de las dos series se
inocula con 0,5 ml de un cultivo del microorganismo de prueba
por 24 horas.
A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una alcuota de cada tubo que
se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estril.
Estos tubos se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el
crecimiento microbiano (aparicin de turbidez).
La mayor dilucin del desinfectante que mate a los
microorganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se
divide por la dilucin mayor de fenol que d los mismos
resultados.
El nmero obtenido es el coeficiente fenlico de ese
desinfectante.
a.2.- Hipocloritos
Funcionan igual al cloro, pero son menos eficaces. Es
una sal de base fuerte y de cido dbil, y se hidroliza:
ClO- + H2O <===> HClO + OH- (Barreiro y Ghislieri)
Se aplica como: hipoclorito de sodio (NaClO), o
hipoclorito de calcio (Ca(ClO)2).
Hipoclorito de calcio: Se ofrece en forma granular y
en tabletas normalmente con 65% de cloro disponible.
Requiere cuidados especiales de almacenaje para evitar
su contacto con orgnicos.
Esta sal al disolverse eleva el pH de la solucin, lo que
puede provocar la precipitacin de carbonato de calcio
(CaCO3). Comnmente se usa en piscinas y pozos.
Hipoclorito de sodio: Se ofrece en soluciones al
15%, 12.5%, 5% (leja) y 1% en el mercado y tambin
produce soluciones alcalinas. Su uso es preferido
cuando se desea no agregar dureza al agua.
ClONa + H2O ---- HONa + HOCl
a,3,. Cloraminas
El cloro reacciona con amonio o con compuestos orgnicos
nitrogenados, produciendo cloraminas.
NH3 + HOCl ---- NH2Cl (Monocloramina) + H2O
NH2Cl + HOCl ---- NHCl2 (Dicloramina) + H2O
NHCl2 + HOCl ---- NCl3 (Monocloramina) + H2O
A corto plazo, las cloraminas son menos efectivas que el ion
hipoclorito, pero son ms estables.
En potabilizacin de aguas, se dosifica suficiente cloro para
satisfacer la demanda natural de cloro (causada por presencia
de orgnicos) del agua y alcanzar el nivel deseado de cloro libre
para proteger el sistema.
Un valor 0.2 mg/L de cloro libre (en el punto ms lejano del
sistema) es suficiente para tener un sistema limpio.
a,4.-Dixido de cloro
ClO2 se usa en desinfeccin del agua potable en
E.E.U.U.
Elimina formacin de THM (trihalomethanos) del cloro.
Gas explosivo, debe producirse in-situ.
El ClO2 es selectivo, solo reacciona con compuestos de
sulfuro reducidos, aminas secundarias y terciarias, y
reactivos orgnicos reducidos. Esto permite menor
dosificacin de ClO2.
Capacidad de matar a esporas, virus y hongos en
concentraciones bajas.
No afecta gusto, olor o aspecto.
b.- Ozono
Es inestable. Agente oxidante ms fuerte y efectivo biocida.
Se genera por descarga elctrica o irradiacin UV de aire con O2
3 O2 ==== 2 O3
Su vida media es de cerca de 20 min. Dosis en agua: 0,5 ppm.
Durante la oxidacin, se divide en O2 y un tomo de O, muy
reactivo:
O3 - > O2 + (O)
La ozonizacin eleva la concentracin de oxigeno disuelto del
agua. Efecto bactericida
Efecto viricida Acta oxidando
las protenas de su envoltura y
modificando su estructura
tridimensional.
El virus no
puede anclarse a ninguna clula
hospedadora por no reconocer su
punto de anclaje.
La ozonizacin previa al proceso
de desinfeccin con cloro reduce la
posibilidad de formacin de
trihalometanos.
Potabilizacin de agua
Pre sedimentacin
Pre cloracin
Se acondiciona el
agua
cruda
aplicando
cloro
contra las algas y
para disminuir la
contaminacin
bacteriana.
Coagulacin
En esta etapa se aplican
coagulantes y floculantes,
como: Sulfato de Aluminio
o policloruro de aluminio, y
Polielectrolitos y a veces
cal.
Decantacin
Los coagulos (FLOCKS) con
mayor peso y volumen se
van al fondo de los
sedimentadores
eliminndose
por
gravedad.
FILTRACIN
Las partculas e
impurezas quedan
retenidas en filtros de
arena.
DESINFECCIN
Se echa el cloro en estado
gaseoso.
Dosis 1 mg/l
a.- Alcoholes
Es
bactericida
y
moderadamente
fungicida.
Desnaturalizan las protenas y desorganizan los lpidos de
sus membranas plasmticas.
Es poco o nada eficaz contra esporas y varios tipos de
virus. Su efectividad es rpida pero de corta duracin
porque tiende a evaporarse.
Debe emplearse en solucin acuosa al 70% v/v, pues:
Concentraciones
mayores
deshidratan
a
los
microorganismos conservndolos en lugar de
destruirlos.
Concentraciones menores son menos eficaces.
Su eficacia para el tratamiento de heridas superficiales es
limitada. Para el lavado de manos tiene una eficacia
similar a la de los jabones.
b.- El fenol
Desnaturaliza las protenas, y desorganiza los lpidos.
En concentraciones superiores al 1% el fenol es
antibacteriano.
Compuestos fenlicos:
Como desinfectante, su olor es desagradable, y es muy
irritante.
Los derivados del fenol ms utilizados son el
hexaclorofeno (compuesto difenlico) y los cresoles (alquil
fenoles).
Los fenoles clorados primero se adsorben a la pared
celular. Despus se difunden a la clula donde quedan en
suspensin y precipitan las protenas.
Clorhexidina
Triclosn (5-cloro-2-(2,4-diclorofenoxi)fenol)
Mecanismo de accin: inhibe la
sntesis de ARN.
Antibacteriano y fungicida. Es
poco soluble en agua, pero se
disuelve en presencia de bases,
por ejemplo en NaOH 1N y en
disolventes orgnicos.
Aplicacin industrial.
Productos del cuidado personal,
cosmticos, pasta de dientes,
enjuagues bucales, desodorantes,
cremas, tratamiento del cne,
lociones y jabones de tocador.
Como agregado en plsticos,
polmeros, textiles y dispositivos
mdicos de implante.
c.- Aldehdos
Son agentes alquilantes que actan sobre protenas, lo que
provoca modificacin irreversible de enzimas.
Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen
esporas.
Glutaraldehido
Formaldehido
Formaldehido.
Se usa tanto en fase gaseosa como en fase lquida. La
solucin acuosa (formol o formalina) contiene del 34 al
38% de principio activo.
Es bactericida, y esporicida, pero de accin ms lenta que
el Glutaraldehdo.
Su uso como esterilizante y desinfectante est limitado
por ser potencialmente carcinognico. (Vives et al)
rgano-Mercuriales
El Mertiolato, metafen, thimerosal y Mercurocromo, son
compuestos orgnicos que contienen mercurio
Son antispticos utilizados en los tratamientos de la piel y
mucosas.
Timerosal. Es el ms utilizado. Tiene actividad
bacteriosttica, ms marcada sobre bacterias Gram(+), con
escasa actividad sobre otros microorganismos.
Su eficacia se mejora por el solvente hidroalcohlico en que
se encuentra diludo. Es muy utilizado como conservador de
soluciones tpicas como colirios. (Vives et al)
Acidos yodados
Son germicidas de amplio espectro, accin sobre bacterias, hongos,
virus e incluso esporas.
Su efecto se debe a la yodacin de protenas vitales para los
microorganismos (altera su estructura proteica y los cidos nucleicos).
Se usan en soluciones yodadas (iodo-ioduro de potasio en alcohol);
que si bien son altamente efectivas; presentan los siguientes
inconvenientes:
Reacciones de hipersensibilidad .
Irritacin del rea tratada por el componente de alcohol.
Quemaduras en caso de que la solucin tenga iodo a ms del 2%.
Un iodforo es un agente solubilizante o portador del yodo con el
que se combina en forma reversible. El complejo resultante provee un
reservorio de liberacin sostenida de iodo libre en solucin acuosa
(libera iodo lentamente). Son de mayor sustantividad que las
soluciones iodo-ioduradas. Los ms empleados son: Iodopovidona, y
Iodoformo .
e.- Colorantes
Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana,
verde de malaquita y verde brillante) bloquean la
conversin del cido UDP-acetilmurmico en UDPacetilmuramil-pptido.
Violeta de Genciana
CMO SE UTILIZAN:
papel
Mercuriales orgnicos,
fenlicos
Cuero
Metales pesados,
fenlicos
Plsticos
Detergentes catinicos
Textiles
Metales pesados,
fenlicos
Madera
Fenlicos
Petrleo
Mercuriales, fenlicos
detergentes catinicos
Aire acondi
cionado
Cloro, fenlicos
Energa
elctrica
Cloro
Nuclear
Cloro
INDUSTRIA:
REFERENCIAS
Romero M., E. Cantn, J. Pemn y M. Gobernado. Antifngicos
inhibidores de la sntesis del glucano. Rev Esp Quimioterap, Diciembre
2005; Vol.18 (N 4): 281-299, 2005 Prous Science, S.A.- Sociedad
Espaola de Quimioterapia.
E. A. Vives, V. Posse, M. L. Oyarvide, G. Prez Marc, D. Medvedovsky
y R. Rothlin. Antispticos y desinfectantes. 2004.
Barreiro Eduardo y Daniel Ghislieri. Eliminacion de microorganismos
desinfeccion.
Juan Alvarado, Gloria Martnez, Jos Navarrete, Enrique Botello,
Mario Caldern, Hugo Jimnez. Fenomenologa de la esterilizacin de
alimentos lquidos enlatados. Rev. Fac. Ing. Univ. Antioquia N. 50 pp.
87-98. Diciembre, 2009