Citometradeflujo

INTRODUCCIN
Lacitometradeflujoseinicienladcada
delos60comounimportanteavanceenel
procesodecontarymedireltamaode
partculasoclulasenpoblacionesno
homogneas.

Citmetrodeflujo
Aparatoqueescapazdemedircomponentesy
propiedadesdeclulasyorganeloscelulares
(partculasbiolgicas)quefluyenenuna
suspensincelular.
Lossorterstienenlasmismasprestacionesy
posibilidadesqueloscitmetrosdeflujoperocon
lacapacidadadicionaldesepararpartculas
selectivamente

ParmetrosmediblesporCMF

APLICACIONES
LaCMFsepuedeemplearparaestudiar
caractersticasestructuralesyfuncionalesde
clulasopartculasensuspensin.Las
aplicacionesfundamentalesdeestatcnicase
danenbiologaymedicinaysonla
identificacinde
antgenoscelularesmediantetcnicasdeinmuno
fluorescencia
yel
estudiodelcontenidodeADNyfasesdelcicloce
lular
.

La CMF se ha utilizado
En hematologa: contaje celular, frmula
leucocitaria, contaje reticulocitario, anlisis de
mdula sea.
En farmacologa: estudios de cintica celular.
En inmunologa: subpoblaciones T, tipaje
tisular, estimulacin linfocitaria.
En oncologa: diagnstico/pronstico,
monitorizar tratamiento.
En microbiologa: diagnstico bacteriano y
vrico, sensibilidad a antibiticos.
En gentica: cariotipo, diagnstico de portador,
diagnstico prenatal.

HISTORIA DE LA CMF
Elprimercontadorcelularautomticofue
desarrolladoporMoldavan(1934)yconsistaen
untubocapilarporelquesehacanpasarclulas
teidas,elcapilarestabamontadosobreun
microscopiopticoconunobjetivosobreelcual
habaundetectorfotoelctricoqueregistrabael
pasodeclulascomouncambioenlaluzque
reciba.Tuvomuchosproblemasconelgrosordel
capilaryobstruccindelmismo,dificultadenel
mantenimientodepresiones,etc..

Cmaradeflujoyfluidode
arrastre
Unimportanteavanceparaeldesarrollode
lacitometradeflujoseconsiguien1953
alinventarCroslandyTaylorunacmara
deflujobasadaenlainyeccindela
muestraenelsenodeunfluidodearrastrea
travsdeuncapilarqueseestrechaycentra
elflujodelamisma

Con este sistema se evitaban

dos grandes problemas
el capilar tiene mayor dimetro
con lo que su obstruccin es
mucho ms difcil
permite mejor el enfoque de la
muestra con la fuente de luz. Es la
base de las cmaras que se usan
en la actualidad.

CitmetrodeCoulter
W. Coulter describi (1949) el
principio que lleva su nombre.
Desarroll un contador celular
basado en el cambio que produce
una partcula al pasar por un
agujero en el que hay una
diferencia de potencial conocida.
En 1966 tambin us cambios en
ondas de radiofrecuencia.

Contadordiferencial
En 1953 Parker y Horst describen
el primer contador diferencial
hematolgico usando clulas
teidas en rojo (hemates) y azul
(leucocitos), luz visible y
detectores para luz roja o azul.

Katmentsky (1965) introdujo

dos avances capitales en CMF
el uso de la espectrofotometra (luz
absorbida) para cuantificar ADN
la medida multiparamtrica de luz
dispersada.
Fue el primero en emplear histogramas
biparamtricos. Algo ms tarde desarroll
un sorter neumtico.
Introduciendo el empleo de sustancias
fluorescentes que permiten una mejor
seal/ruido que los colorantes de absorcin.

196769VanDilla
Describeelprimercitmetrodeflujocon
configuracinortogonalusandolacmara
descritaporCroslandTaylor.
Demostraronlarelacinexistenteentre
ploidaeintensidaddefluorescenciaenla
cuantificacindeADN,yproducen
histogramasdondesepuedenvisualizarlas
fasesdelciclocelular(G0G1,faseS,G2M)

ConfiguracinpticadeunCMF

Sorterelectrosttico
Fulwyler describe el proceso de
sorter electrosttico en 1965
basndose en la tecnologa de las
impresoras de chorro de tinta.
Sistema mayoritariamente
empleado en la actualidad.

 Durante los aos 60 y 70 se producen

avances en la tecnologa y su aplicacin
a la citometra de flujo pero hasta final
de los aos 70 y principio de los 80
existan pocas aplicaciones de la
citometra de flujo de inters biolgico.
Los esfuerzos se dirigan principalmente
en mejorar las prestaciones de los
instrumentos que se estaban
desarrollando.

AvancesenlasaplicacionesdelaCMF
enlainvestigacinmdicobiolgica
Reinherz (1975) emplea la tecnologa de los
anticuerpos monoclonales de Kholer y Milstein
para identificar subpoblaciones celulares en
funcin de antgenos de superficie.
Loken (1977) mide simultneamente dos
antgenos celulares con un solo lser, emplea
la compensacin electrnica de la seal entre
isotiocianato de fluorescena (FITC) y la
tetralmetilrodamina.
Oi (1982) introduce las ficobiliprotenas como
flourocromos (ficoeritrina).

AvancesenlasaplicacionesdelaCMF
enlainvestigacinmdicobiolgica
Dazrynkiewicz y Traganos (1976-79) estudian
con naranja de acridina el ADN y ARN.
Andreeff usa dicha tcnica para clasificar las
leucemias.
Grynkiewicz (1985) introduce el Indo 1 para
medir concentracin intracelular de calcio.
Entre 1979-80 varios autores describen
tcnicas citomtricas para medir condiciones
fisiolgicas: Visser (pH intracelular), Valet
(carga de superficie), y Thorell (estado redox).

AvancesenlasaplicacionesdelaCMF
enlainvestigacinmdicobiolgica
Hedley (1983) pone a punto una tcnica para
el estudio por citometra de flujo del ADN de
ncleos de muestras parafinadas.
Gratzner (1975) describe la tcnica de la
bromodeoxiuridina (BrdU) y los anticuerpos
contra ella, que permite ampliar el estudio de
las fases del ciclo celular.
Gray (1975) realiza el cariotipo por citometra
de flujo. Este procedimiento fue
posteriormente mejorado por Carrano.

Fluorocromos

Ofrecenunmtodosensibleparaobtener
informacinacercadelaestructura,
funcinyvitalidaddelasclulas.
Mododeuso:
1. unincovalentedelfluorocromoamolculas
queseunenespecficamenteacomponentes
celulares,y
2. fluorocromosquevaransuscaractersticasen
funcindelmicroambientequelesrodea.

FluorocromosutilizadosenCMF

Propiedadesidealesdeun
fluorocromo
altocoeficientedeextincinalalongitudde
ondadeexcitacin(probabilidadde
absorberlaluz),
altorendimientocuntico(emisindeluz),
elevadafotoestabilidad,
cortoestadodeexcitacin.

 Sielfluorocromovaaestarunidoaalgo,
steserinsensibleacambiosdepH,
polaridadymicroambiente.
Recordarquealongitudesdeonda
inferioresa500nmseproduceunaalta
autofluorescenciacelulardebidoalas
flavinas.

Marcadoresfluorescentesde
unincovalente
Sonfluorocromosquereaccionanyseusan
paramarcarprotenas,lpidos,obienotras
molculasbiolgicas.
Debensersuficientementeselectivosy
reactivos.
Porsucapacidaddeuninseemplean
cromforoscongruposisotiocianato,
clorotrirzinil,ysteresdesuccinimida.

Fluorocromoscovalentesms
empleados(excitablesa488nm)

FLUORESCEINA.
RODAMINA,
ROJOTEXAS,
CIANINAS
FICOERITRINA(ficobiliprotena),famoso
porsugranabsorcin,rendimientoy
fotoestabilidad.

Fluorocromosqueseunenno
covalentementeaestructurascelulares
Debidoasucomposicinmolecularseunenadeterminados
componentescelulares.
MarcadoresdelcontenidoenADNyARN
SegneltiposonmsomenosespecficosparaelADN,ARN,o
determinadasbases.
Hoechst33342(UninaAT,vital),
DAPI(AT),DIPI(AT),
cromomicinaA3(UninaGC),
olivomicina(GC),mitramicina(GC).
NaranjadeacridinaseunealADNyARNperotienelaparticularidadde
emitirendiferentelongitudsegnaltipodecidonucleicoalqueest
unido.
Iodurodepropidio(uninintercalante)queseexcitaconunlserde488
nm.

Fluorocromosqueseunenno
covalentementeaestructurascelulares
Marcadoresdelpotencialdemembrana
Cianinasylarodamina123.Tambinmarcar
mitocondriasdebidoalaaltadiferenciade
potencialentresumembrana.

Marcadoresdemembranaylpidos
marcadoresquediferenciancompartimentos
condistintopH:pocousadosencitometrade
flujo.

Marcadoresfluorescentesquesonsensibles
almicroambientequelesrodea
Varan su espectro de absorcin o emisin en funcin
de las caractersticas del microambiente que les rodea.
Se emplean para la determinacin de diversos estados
funcionales celulares
pH (6-carboxi-fluorescena, 2,3-diciano-1,4-dihidroxidenceno,
hidroxipireno trisulfato),
calcio (quin II, fura-2, indo-1),
potencial red-ox (diclorofluorescena, NADH, NADHP),
actividad enzimtica (substratos que por accin del enzima
varan su fluorescencia o espectro),
polaridad (anilino-naftalina-sulfato o ANS),
viscosidad/fluidez.

Tcnicasinmunofluorescentes,
inmunofenotipaje
Enladiferenciacinymaduracincelularseexpresan
genes,algunosdelosproductosespecficosseexpresan
enlasuperficiecelular,estopermitecaracterizar
subpoblacionescelulares.
Laproduccindeinmunoglobulinas(anticuerpos)apartir
deunsololinfocitosB(anticuerposmonoclonales)
permiteidentificarantgenosmuyespecficamente.
Elfluorocromoqueseconjugaalanticuerpoactacomo
unsimplemarcadorconelquesepuedenmarcardistintos
anticuerpos(facilitalastandardizacindelsistemaptico
delcitmetro).

Usodesorters
Launindelanticuerpoalaclulanola
mata,loquepermiteutilizarsortersparala
caracterizacinfuncionalobioqumica
posteriorenfuncindemarcadores
celularesdesuperficie.

Factoreslimitantes
Lafrecuenciarelativadelasclulas
condicionalaestrategiademarcajeparasu
bsqueda
Laelevadadiferenciadeexpresinenla
superficiecelulardelosantgenos(incluso
enpoblacionesclonadas).
Laestrategiatambindependedelo
precisosquedebanserlosresultados.

INCREMENTO DE LA
SEAL/RUIDO
Aumento de la seal fluorescente:
Antisueros policlonales:
mezcla de anticuerpos heterlogos.
Son necesarios antgenos puros para inmunizar y
el suero necesita de repetidas purificaciones para
que sea suficientemente especfico.
Tienen la ventaja frente a los anticuerpos
monoclonales que son heterogneos y pueden
reconocer diferentes partes de la molcula del
antgeno, y el resultado final es que producen una
seal fuerte de fluorescencia.

INCREMENTO DE LA
SEAL/RUIDO
Aumento de la seal fluorescente:
Anticuerposmonoclonales:
Losclonasresultantesproducencantidadesde
anticuerpomonoclonalquepuedeserpurificaday
obtenidoindefinidamente.
Laventajaesquenosenecesitadeantgenospuros
parainmunizarpuestoqueseseleccionanclulas
determinadasyelanticuerpoesmuyespecfico(se
eligeelmejor,msespecfico,msfcildeconjugar
conelfluorocromo,etc.).

INCREMENTO DE LA
SEAL/RUIDO
Aumento de la seal fluorescente:

Tincininmunofluorescente:
sepuedenusartcnicasdirectas(pocobackground
perofluorescenciadbil)o
indirectas(aumentaelbackgroundperoaumentala
fluorescenciaporamplificacindelaunin).
Parareducirelmarcajeinespecficoporreceptores
FcsepuedenemplearfragmentosF(ab)2ola
tcnicadelastreptavidinabiotina.

INCREMENTO DE LA
SEAL/RUIDO
Aumento de la seal fluorescente:

Seleccindelfluorocromo:
esimportanteelnmerodemolculasunidasal
anticuerpo,porquesiaumenta,aumentala
fluorescencia,hastaqueporproximidadseproduce
artefactuacindelaemisinodelespectro.

INCREMENTO DE LA
SEAL/RUIDO
Disminucindelbackgroundyruido:
Background(marcajeinespecfico):

SepuedereducirutilizandoslolaparteF(ab)2delosanticuerpos,
Evitarclulasmuertasquecaptanalanticuerpodemodoinespecfico
(odiscriminarconiodurodepropidio);
procesamientodecontrolesnegativosyseleccindeseal
inespecfica,
correccininformticadesolapamientoespectralendoblemarcaje.
Hayquetenerencuentaelprocesodetransferenciadeenergacuando
semarcacondosfluorocromos(muycercanosenelespacio).

INCREMENTO DE LA
SEAL/RUIDO
Disminucindelbackgroundyruido:

Autofluorescencia:
lacantidaddeautofluorescenciadependedeltipocelularyde
susestadodeactivacin,yseatribuyealasflavinasyotros
coenzimas.
Dependetambindelalongituddeondadellser(disminuye
alaumentarlalongituddeonda).
Tambinhayqueeliminarelruidoproducidoporelaparato
confiltrospticoseficientesycompensacindecolor.

INCREMENTO DE LA
SEAL/RUIDO
Disminucindelbackgroundyruido:

Otrastcnicas:
Aumentarlafrecuenciarelativadelasclulasdeseadasenuna
poblacinheterogneamejorasudiscriminacindelrestante
declulas:
Sepuedeconseguirpurificandolasclulasantesdesuprocesamiento
porcitometra(lisisdeloshematescentrifugacin,etc.)
conanlisismultiparamtrico(empleardispersinfrontalylateralde
luzparadiferenciaraloslinfocitos,laresistenciaelctricapara
discriminarenfuncindetamao,iodurodepropidioparaeliminarlas
clulasmuertas,etc..).

INCREMENTO DE LA
SEAL/RUIDO
Disminucindelbackgroundyruido:

Almacenamientodelasmuestras:

Lapartculasoclulasdebenseranalizadasinmediatamentedespus
delmarcajeinmunofenotpicoodebenserfijadas.
Lasclulasvivassedebenguardarenmediosdecultivoyconun0,1
%deNaH3enhielo(4grados)paraevitarcambiosenlas
condicionesbiolgicas.
Sisepuede(noseprecisaviabilidadcelular)lasclulassepueden
fijarenun1%deparaformaldehidoenPBSyguardara4gradosen
oscuro,conloquenodisminuyelafluorescencianicambianlas
caractersticasdedispersindelaluzysepuededemorarlalectura
variosdas.

PRESTACIONES DE LOS
CITMETROS DE FLUJO
Sensibilidad:
cantidad mnima de molculas de un fluorocromo
determinado que pueden ser medidas con cierta
precisin (resolucin),
para la luz dispersada, es el tamao menor o ndice de
refraccin que puede ser medido con cierta precisin.
Depende de muchos factores, incluso del fluorocromo.
La sensibilidad aumenta si se disminuye la velocidad
de flujo (paso) manteniendo constante el dimetro del
flujo interno (muestra).

PRESTACIONES DE LOS
CITMETROS DE FLUJO
Resolucin (expresado como
coeficiente de variacin):
es la reproductibilidad de la seal
producida por clulas o partculas
idnticas.

CoefficientofVariation
%CV Definition =

St.Dev x 100
MEAN

CV=3.0
CV=3.0

MEAN
Crucial in establishing:
alignment
Fluidic stability
Staining of cells

PRESTACIONES DE LOS
CITMETROS DE FLUJO
Velocidad de medida:
Es la velocidad media mxima a la que las
clulas pueden ser medidas sin exceder
una frecuencia determinada de
coincidencias (dos clulas detectadas
como una sola).
En los citmetros lser oscila alrededor de
5.000 clulas/segundo.

Ciclo celular y aneuploida

estudiados por CMF
Los cidos nuclicos son polmeros formados
por un esqueleto de fosfato-azcar
(ribosa/desoxirribosa) 5-3-5 y esta ltima
con una base (ADN: AT y GC; ARN: AU y CG).
Los cidos nuclicos pueden ser de hebra
sencilla o apareados en una doble hebra
complementaria.
Para una buena lectura interviene:
el fluorocromo, equipo, muestra, etc..

Fluorocromos en el
anlisis del DNA:
Lasealfluorescenteesproporcionalalaunin
estequiomtricadelfluorocromoalcidonucleico.
Seclasificanenfuncindesumecanismodeunin
en:
intercalantes(bromurodeetidio,iodurodepropidio,
naranjadeacridina);
uninpreferenteaAT(DAPI,DIPI,Hoechst);
uninpreferenteaCG(mitramicina,olivomicina,
cromomicinaA3).

Fluorocromos en el
anlisis del DNA:
Phenantidium: del tipo del bromuro de
etidio y ioduro de propidio.
Especificidad por el ADN y ARN de doble cadena
(tratamiento con ARNasa si slo se desea medir
ADN).
Excitacin en el azul/verde-rojo.
Precisan de clulas muertas y fijadas, disminuye
la intensidad de la seal y la especificidad la
unin secundaria a los grupos fosfato, proteasas,
ADN estructura Z, bromodeoxiuridina. No se
afecta por el pH y la composicin de bases.

Fluorocromos en el
anlisis del DNA:
Bismenimidazoles y afines: tipo Hoechst,
DAPI y DIPI.
Tienen elevada especificidad por el ADN y se
unen a las bases AT.
Excitacin en el ultravioleta-azul. Tien clulas
vivas.
Disminuye su intensidad con el pH cido (que
aumenta la unin secundaria), concentracin en
exceso, bromodeoxiuridina, y la unin
secundaria.
El DAPI y DIPI se usan para hacer las bandas
cromosmicas.

Fluorocromos en el
anlisis del DNA:
Cromomicina y similares: como la
cromomicina A3, mitramicina, olivomicina.
Se unen a las bases CG del ADN.
Excitacin en el espectro ultravioleta-azul/verde.
Requieren del in magnesio (Mg) para la unin,
pueden teir clulas vivas.
No afecta el pH.

Otros: quinacrina (intercalante), naranja de

acridina (unin al ADN y ARN bicatenario,
emisin diferencial).

Factores que influyen en la

unin del fluorocromo al cido
nucleico
Muestra a analizar: depende de
la composicin de bases (AT, CG), de la presencia de bases
modificadas (bromodeoxiuridina) o metilacin, estructura
del ADN.
la unin entre las protenas cromosmicas (histnas) y
ADN, una unin fuerte entre ellos (formol) dificulta la
incorporacin del fluorocromo, se puede hacer incubacin
con proteasas.
la membrana citoplasmtica (el ioduro de propidio no la
atraviesa), y
componentes intracelulares.

Factores que influyen en la

unin del fluorocromo al
cido nucleico
Qumica, cintica y equilibrio de la
unin: depende de
la concentracin de sales del medio
(favorece la disociacin histona-ADN),
fuerza inica (inhibe unin secundaria),
la cromomicina necesita Mg, el pH (el pH
cido favorece la unin secundaria del
Hoescht).
Se debe tener cuidado con la concentracin,
las condiciones y el tiempo de incubacin.

Ciclo celular y aneuploida

Tcnicas para medir la sntesis

de ADN, y el ciclo celular
La intensidad de fluorescencia es
proporcional a la cantidad de
fluorocromo, que es proporcional a la
cantidad de ADN de la clula.
Hay cierta variacin entre el resultado
terico y el obtenido, por ello se define
el coeficiente de variacin (CV) que nos
da una idea de la semejanza de los
resultados obtenidos a la realidad.

Tcnicas para medir la sntesis

de ADN, y el ciclo celular
A partir del histograma, para calcular la
fase S, se pueden emplear varios
mtodos informticos: rectangular, lineal,
polinomial, Gauss. El resultado vara
segn el mtodo.
Se puede hacer doble marcaje con ioduro
de propidio y la tcnica de la
bromodeoxiuridina-antibromodeoxiuridina
para conocer la sntesis real.

Anlisisdelciclocelularpor
CMF

2n

4n

Deteccindeaneuploidade
ADN
Eltrminoaneuploidasignificapresencia
deunapoblacinconuncontenidoenADN
diferenteauncontroldeclulassemejantes
yenigualfasedelciclocelular.

ndicedeADN(ID)
EselcocienteentrelamodadelpicoG0G1dela
poblacinproblemaylamodadelpicoG0G1delcontrol
(en%).
Apartirdeahsedefine:

diploidesiIDigual1,
aneuploidesiIDdiferentede1,
hiperploidesiIDsuperiora1,
hipoploidesiIDinferiora1,
poliploidesiIDesiguala1.5,2,2.5,etc.,
haploidesiIDesiguala0.5).

Discriminacindedobletes
Undobleteescuandoelcitmetroanaliza
dosclulasalmismotiempo.
Lasolucinsedebebuscarenlatcnica,
criteriosdestandardizacinysoluciones
citomtricasdeanlisisdelaseal.

Criteriosparaconsiderar
aneuploida
presenciadedospoblacionesenlamuestra,
coeficientedevariacindelapoblacin
aneuploidemayorquelaeuploide,
presenciadeclulasenlaregindeG2Mde
lapoblacinproblemadudosamente
aneuploide,
proporcionalidadentrelasfases,
comprobarlospicoscondistintastcnicas.

Estndares y Controles
en CMF
Estndares (Patrones de
normalidad):
Un estndar es un material estable que tiene
valores determinados de fluorescencia o
dispersin de luz.
Se usan para alinear o calibrar las prestaciones del
citmetro de flujo.
Hay comerciales o se los puede preparar uno
mismo.

Estndares y Controles
en CMF
Alineamiento y prestaciones: el uso de
estndares de alineamiento proporciona un buen
mtodo para detectar cambios y problemas en la
configuracin ptica y seal de un da a otro.
El citmetro de flujo se considera alineado cuando
se consigue una elevada fluorescencia o seal con
un bajo CV.
Se debe comprobar para todas las seales y llegar
a un compromiso entre ellas porque a veces
cuando una aumenta la otra disminuye.

Estndares y Controles
en CMF
Calibracin (ajuste de escalas): los citmetros de flujo
ofrecen una informacin relativa, no absoluta. Para
cuantificar hay que correlacionar los canales con resultados
de muestras conocidas.
El mtodo ms sencillo consiste en ajustar el voltaje del
fotodetector (produce cambios exponenciales o no-lineales
de la seal) y/o ganancias (crecimiento lineal) para
conseguir un pico de una intensidad determinada de un
standard estable cada da.
Es el equivalente a reseleccionar el citmetro a una escala
de intensidad relativa constante.
Tambin es til hacer una calibracin cruzada de escalas
logartmicas y lineales.

Estndares y Controles
en CMF
Compensacin de color: en las aplicaciones citomtricas con
dos o ms fluorescencias nuestro objetivo es marcar las clulas
con fluorocromos distintos que reflejen las diversas propiedades
celulares diferentes y detectar la seal proporcional a la primera
fluorescencia (FL1) en un detector y la de la segunda (FL2), etc,
sin desviaciones producidas por interferencias de la seal.
Los fluorocromos tienen espectros de emisin que en ocasiones
se superponen y los filtros no son perfectos, por ello los
citmetros poseen un sistema informtico de compensacin o
sustraccin de seal.
Es difcil predecir tericamente el grado de compensacin y hay
que ajustarlo individualmente. Generalmente se debe extraer
FL1 (fluorescena) de FL2 (ficoeritrina), y tambin FL3 (ioduro
de propidio) a FL2 y FL1 (fluorescena).

Estndares y Controles
en CMF
El tiempo como standard: en los citmetros que
lo permiten, se pueden hacer grficas del nmero
de clulas procesadas, del canal de fluorescencia,
etc.. a lo largo del tiempo.
Se puede usar para ver la estabilidad de las
mediciones del citmetro con el tiempo y detectar
la presencia de algn problema.

Estndares y Controles
en CMF
Control de calidad: Hay que asegurarse que el citmetro
funciona bien cada da para poder comparar los resultados.
Hay dos mtodos:
(1) no variar las condiciones de lectura y apuntar el canal
medio del pico standard y hacer curvas de da a da, y
(2) fijar la posicin constante del pico del standard variando las
condiciones de lectura (fotodetectores) y hacer curvas.

Las dos son vlidas pero es ms sencilla la primera por que

la segunda tiene una variacin no-lineal. Se pueden hacer
ambas.

Controles
Loscontrolessonmaterialesqueproduce
resultadosesperados(conocidos).
Seusanparamonitorizarlasprestacioneso
reproducibilidaddelosreactivosylacalidadde
losmtodosdepreparacincelular.
SonimportantesenlosanlisisdeADNe
inmunofluorescencia.
Seusancontrolesdeploidaycontrolesde
inmunofluorescenciapositivosynegativos.

ParacuantificacindeADNyanlisis
delasfasesdelciclocelular:
Comocontroldeploidasedebeusarun
controlinterno,procesadoenelmismotubo
quelamuestra,paradescartaroasegurar
aneuploidaycalcularenndicedeADN
(tambinsepuedeprocesarporseparadoy
mezclar),yotrotuboparacalcularlasfases
delciclocelular.

ParacuantificacindeADNyanlisis
delasfasesdelciclocelular:
Lasmejoresclulasdereferenciason
clulasdiploidesdelmismoindividuoeigualtejido,
sindeigualtejido,y
sindediferenteindividuoytejido,yporltimode
otraespecieanimal.
PararealizarunabuenalecturadeADNsedebeteneral
citmetrodeflujoenperfectascondicionesysercuidadosoen
elprocesodepreparacindelamuestraytincin.
Sedebenusarcontroles.Elanlisiseinterpretacinsehace
medianteelsoftwareadecuado.

ParaInmunofluorescencia
Senecesitancontrolesnegativospara
descartarunininespecficadel
fluorocromoyseleccionarelumbralde
autofluorescencia.
Soncausasdetincininespecficalos
fragmentosFcdelainmunoglobulinas,las
clulasmuertas,debrs,etc...

ParaInmunofluorescencia
Sitenemosproblemasconelcontrol
negativosedebeprocurarprocesarcon
cuidadolasmuestraspreservandosu
viabilidad,utilizarfragmentosF(ab)2o
centrifugarelanticuerpomonoclonalpara
evitaragregados,eliminarlasclulas
muertascondoblemarcajeconiodurode
propidioydiacetatodefluorecena.

ParaInmunofluorescencia
Siapesardetodoseguimosobteniendouna
distribucinunimodalconconsiderablesuperposicin
entreelcontrolnegativoyelcontrolpositivo,
podemosasumir(conciertasreservas)quelatincin
esespecficaperodebajaintensidad(noesseguro).
Loscontrolespositivossontambinesencialespara
comprobarquelatcnicafunciona.Sinoseemplean
losresultadosnegativosdeunamuestraqueseespera
positivanosesabesisonporalteracinantignicao
fallodemarcaje.

Log/lindisplay

4colorssimultaneouscollection
FITC

PE

PETR

PE-CY5

530
580 630
680 730
Emission wavelength (nm)

780

Detection Threshold (noise)

1,000,000

Antibody Binding Capacity

100,000

10,000

1,000

100

10

1
0

50

Mean

100

98%

150

200

Histogram Channel
Slide from Dr. Abe Schwartz

250

ComparisonofWindowsofAnalysisin
SampleSpace
Coef. of Res = 85.3

Coef. of Res = 64.0

(3 decade log amp)

(4 decade Log amp)

255

Zero
Channel
Value

0
ABC Sample Space
Slide from Dr. Abe Schwartz

BasicsofFlowCytometry
Fluidics cells in suspension
flow in single-file through

Optics

an illuminated volume where they

scatter light and emit fluorescence
that is collected, filtered and

Electronics

converted to digital values

that are stored on a computer

[RFM]

FlowCytometry:
Theuseoffocusedlight(lasers)tointerrogate
cellsdeliveredbyahydrodynamicallyfocused
fluidicssystem.
Flow Cell

Fluorescence
signals
Focused laser
beam

Sheath
fluid

FluidicsSystems
Positive Pressure Systems
Based upon differential pressure
between sample and sheath fluid.
Require balanced positive pressure
via either air or nitrogen
Flow rate varies between 6-10 ms-1

+++
+++
+++

Positive Displacement Syringe Systems

1-2 ms-1 flow rate
Syringe
Fixed volume (50 l or 100 l)
Absolute number calculations possible
Usually fully enclosed flow cells

Flowcell

100 l

3-way valve

Sample
Sample loop

Waste

FluidicsParticleOrientationandDeformation
a: Native human
erythrocytes near the
margin of the core stream
of a short tube (orifice).
The cells are uniformly
oriented and elongated
by the hydrodynamic
forces of the inlet flow.
b: In the turbulent flow
near the tube wall, the
cells are deformed and
disoriented in a very
individual way. v>3 m/s.

[RFM]

Image fromV. Kachel, et al. Melamed

Chapt. 3

HydrodynamicSystems
Sample in

Sheath
Piezoelectric
crystal oscillator
Sheath in

Fluorescence
Sensors
Laser beam

Scatter Sensor

Sheath
Core

Hydrodynamicallyfocusedfluidics

Hydrodynamicallyfocusedfluidics

Signal

Increase Pressure:
Widen Core
Increase turbulence

HydrodynamicSystems
Flow
Cell

Fluorescence
signals
Focused laser
beam

Injector
Tip

Sheath
fluid

Flow Cell
Injector
Tip

Fluorescence
signals
Focused laser
beam

Sheath
fluid

Fluorescence collection lens, optical filters,

dichroic filter, band pass filter

J.Paul Robinson
Professor of Immunopharmacology
School of Veterinary Medicine, Purdue University

reflector
Beam shaping lens

From
laser