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INVESTIGACION

APLICADA
Diana C.Charaja
Rosmery Cardenas Urtado
Dalia Chacon Sanchez

INTRODUCCION
Actinomicetos
bacterias filamentosas parecidas superficialmente a los hongos.
El crecimiento es un micelio ramificado que tiende
bacterianos
Tiene un rol en la descomposicin de materia orgnica: la

a fragmentarse en elementos

celulosa y quitina.
Renuevan las reservas de nutrientes en la tierra y son fundamentales en la formacin de
humus.

La
La mayora
mayora son
son seres
seres aerobios
aerobios estrictos,
estrictos, que
que crecen
crecen bien
bien a
a
temperaturas
del
orden
de
los
25C,
son
microorganismos
temperaturas del orden de los 25C, son microorganismos mesfilos;
mesfilos; yy
a
a pH
pH alcalino
alcalino (pH
(pH
9).
9).
Producen
Producen vitaminas
vitaminas (principalmente
(principalmente del
del grupo
grupo B),
B), antibiticos
antibiticos yy
pigmentos
pigmentos de
de gran
gran inters
inters industrial.
industrial.

Estreptograminas:
Producidas por diversas especies de streptomyces
Constituyen un amplio conjunto de pptidos cclicos
Grupo de antibiticos formados por 2 componentes: estreptogramina A y
estreptogramina B
Ambas inhiben la sntesis proteica bacteriana,
Actuando sobre el dominio de la peptidil-transferasa de la subunidad
ribosomal

En 1953, fue aislado un


nuevo Streptomyces
(graminofaciens) capaz de
producir un grupo de sustancias
antibiticas

estreptograminas

estreptograminas:
Micamicina,
pristinamicina,.

vernamicina
virginamicina

En los ltimos aos se


desarroll una investigacin
sobre un derivado
semisinttico de esta familia
quinupristinadalfopristina

D/Q MECANISMO DE ACCIN

Inhiben la sntesis de protenas al unirse a la subunidad ribosomal 50S. Un derivado, la quinupristina,


inhibe la elongacin de la cadena polipctidica y la dalfopristina interfiere directamente con la peptidil
transferasa.
Ejercen su actividad a nivel del ribosoma bacteriano.

El componente A se une al peptidil tRNA y bloquea la unin de nuevos aa.

El componente B impide la elongacin de la cadena peptdica.

El componente A aumenta la afinidad del componente B por la subunidad 50S

La combinacin de A+B es bactericida

Aplicaciones industriales y ambientales


El orden Actinomycetales se reconoce en la industria
farmacutica. existen una amplio nmero que inhibe
microorganismos blanco sensibles a esos antibiticos (patgenas
humanas, animales o vegetales). Los Streptomyces son los mas
comunes.
La estreptomicina es un antibitico aminoglucsido producido
por Streptomyces griseus.
Las especies de Streptomyces hidrolizan la quitina, tambin y
otras la celulosa y las hemicelulosas. Nocardia oxida
hidrocarburos del tipo de las parafinas, fenoles, esteroides, con
la posibilidad de emplearlos en biorremediacin

La mayoria de
antibioticos son
sustancias
producidas por
Streptomycetos

Se han utilizado con


xito en la
agricultura,industria
alimentaria, y en la
medicina

VERNAMICINA

Pertenece al grupo depsipeptidos


Es activo contra gram +y gramPM: 422,38 g/mol
Formula empirica C20H25O5N2
Espectro absorcion 230-270 nm

Este antibiotico
Vernamicina
probablemente
inhibe la union
inhibe la formacion
de fmet-tRNA a
enlaces
los ribosomas 70 de
peptidicos mediante
S en la sub
la inhibicion de union
unidad 50S
ARNt al ribosoma

Resumen
Se aislaron 75 cepas de
actinomycetos
denominadas AZ-SH-29
de diferentes muestras
de suelo de diferentes
localidades de Egipto

Tiene similitud con


genero Streptomyces
Morfologia,fisiologia,cara
ct. Bioquimicos.

Estas bacterias
producen un agente
antimicrobiano amplio
espectro

Durante la formacin
agente antimicrobiano
Parmetros de control:
pH,Temp,periodo de
incubacion y diferentes
fuente de carbono y
nitrogeno

Para extaer metabolito


activo se uso ACETATO
DE ETILO (1:1 a pH7)

Para separar y purificar


el ingrediente activo se
uso Cromatografia en
columna (CC)

Este analisis
indica la
formula
empirica
C20H25N2O5

Se determino las
concentraciones
minimas de
inhibicion (CMI)

El agente
antimicrobiano
purificado
pertenece a
depsipeptidos
(MICAMICINA) del
grupo
Vernamicina
producido po S.
ramulosus.

Materiales y Metodos

Aislamiento
actinomiceto
AZ-SH-29

Se aislo apartir
de muestras de
suelo
Se purifico
utilizando
tecnica
Dilucion en placa

Deteccin actividad
antimicrobiana

Lecitinasa---medio yema de
huevo
Lipasa
Proteasa
Pectinasa
A amilasa
Pruebas
bioquimicas
Prueba catalasa
Reduccion nitrato
Produccion H2S
(utilizand diferentes
fuentes de carbono
y nitrogeno

Estudio de
caracterizacin del
actinomiceto aislado

Morfologicas: hifas
aereas, masa de
esporas, superficie de
esporas,color micelios
aereos
Y el sustrato
Fisiologicas y
bioqquimicas:
Se detecto

Parmetros de control en la
biosntesis del agente
antimicrobiano
Incluyen:
Tamao inoculo
Periodo
incubacion
Valores Ph
T incubacion
Fuentes carbono
y nitrogeno
(glucosa , nitrato
de sodio

Fermentacion
Extraccion
Precipitacion
Purificacion

Micrografia electronica de
barrido del actinomiceto
aislado
Crecio en un (medio de agar
+ almidon+nitrato)

Bioautografia del agente


antimicrobiano

20 ul de compuesto
purificado fue
cargado en tiras de
papel de
cromatografia
Se secaron al aire y
colocaron e placas de
agar sembradas
con-. Micrococcus,
S.aureus,B.Subtilis
E.Coli, Klebsiella y
candida albicans
Como cepas
bacterianas de
prueba

Analizaron las
propiedades fisicoquimicas del agente
antimicrobiano

Analisis
elemental
C,H,ON, S
Analisis
espectroscopico
(IR,UV,espectro
de masas y
espectro RMN)

Se evaluo
reaccion del
agente
antimicrobiano
con siguientes
pruebas:
Rx Molish
Rx Fehling
Nihidrina
Nitroprusiato
Cloruro ferrico
Rx Mayer

Se determino su
actividad biologica
Con la prueba de CMI

Resultados

1.La deteccin de
las actividades
antimicrobianas
Bacterias Gram
positivas
Bacterias Gram
negativas
Hongos unicelulares

2.Caracterizaciones
del actinomiceto
aislado, AZ-SH-29
2.1Caractersticas morfolgicas

Espiral
Gris rosa
Lisa
Micelio marrn amarillento
Pigmento difusible marrn

2.2 Pared celular hidrolizada:


contiene acido diaminopimelico

3.Caractersticas
fisiolgicas y
bioqumicas

Hidroliza protenas, almidn, pectina de lpidos, lecitina, y celulosa

La prueba de catalasa y el pigmento melanina es negativo

La degradacin de la xantina, esculina, la produccin de H2S y la reduccin de nitrato son positivos

Descomposicin de la urea; y la utilizacin de citrato son negativos.

El aislado AZ-SH-29 utiliza D-manosa, D-glucosa, Ramnosa, manitol, L-arabinosa, Rafinosa , maltosa, LCycteine, L-fenilalanina, L-Arginina, y citrato de sodio
D- galactosa, sacarosa, meso-inositol, lactosa, L-Valina, y L-histidina son negativos
Crecimiento en presencia de hasta (10%) de NaCl
El crecimiento no se inhibe en presencia de azida de sodio y fenol

El aislado de actinomicetos no es resistente a la amoxicilina, Augmentina, carbenicilina, Cefadroxilo,


Gentamicina, Cephardine, Ceptrine, Chloramphinicol, Cloxacillina, doxiciclina, eritromicina, Keflex, y Noroxin.

3.1.Caractersticas de color y cultivo


El aislado AZ-SH-29 exhibi un buen crecimiento en el medio agar de almidn-nitrato , el micelio areo es
gris medio, micelio de sustrato es de color marrn amarillento claro, y pigmento difusible es marrn
amarillento moderado
No hay crecimiento en el medio de caldo de extracto de triptona-levadura (ISP-1)
un buen crecimiento en el medio agar de extracto de malta-levadura (ISP-2) , el micelio areo es marrn
amarillento claro y el pigmento difusible es de color marrn amarillento moderado.
No hay crecimiento en medio de agar de avena (ISP-3).
Se detect un crecimiento moderado en medio de agar de sales inorgnicas-almidn (ISP-4) el micelio
areo es de color rosa grisceo, micelio sustrato es amarillo naranja plido y el pigmento difusible es
brillante amarillo-naranja.
No hay crecimiento en el medio de agar glicerol - asparragina (ISP-5).
Buen crecimiento fue detectado en medio de agar de extracto de levadura y peptona (ISP-6), el micelio
areo del medio es gris medio; micelio de sustrato es marrn amarillento claro y pigmento difusible marrn
moderado.
Se detect buen crecimiento en medio de agar tirosina (ISP-7), el micelio areo es gris claro, micelio
sustrato es marrn claro y pigmento difusible es marrn amarillento moderado

4. Identificacin del actinomiceto aislado, AZ-SH-29


AZ-SH-29 es sugerente de relacionarse con Streptomyces ramulosus

5. Parmetros que controlan la biosntesis del agente antimicrobiano

Periodo de incubacin: 5 das


Valor de pH: pH 7
La temperatura de incubacin: 25 C
Fuente de carbono: Glucosa 2.5 mg/100ml
Fuente de nitrgeno: nitrato de sodio 0.25 mg/100 ml

6. Fermentacin y aislamiento del agente


microbiano
El proceso de fermentacin se
realiz durante cinco das a
30C
Filtracin
Centrifugacin a 5000 rpm
durante 15 min

Los filtrados
transparentes fueron
ajustados a pH 7,0
acetato de etilo al
nivel de 1: 1 (v / v)
La fase orgnica se
recogi, y se evapor
bajo presin reducida
usando un evaporador
rotatorio

La fase orgnica se
recogi, y se evapor
bajo presin reducida
usando un evaporador
rotatorio
El material residual se
disolvi en la menor
cantidad de DMSO y
filtrado

El agente
antimicrobiano se
precipit por el ter de
petrleo (pe 60-80? C)
y se centrifug a 4000
rpm durante 15 min
donde un precipitado
en polvo de color
marrn podra ser
obtenido
El proceso de
purificacin a travs de
cromatografa con gel
de slice

7. Bioautografa del Agente(s) antimicrobiano


purificado

8. Caractersticas fsicoqumicas del agente


antimicrobiano

8.1. Anlisis elemental

El agente antimicrobiano purificado produce


olor caracterstico, su punto de fusin es de
195 C.
El compuesto es soluble en cloroformo, acetato
de etilo, Demso, n-butanol, y dietil ter, pero
insoluble en agua, ter de petrleo, y hexano.

Los datos analticos elementales del agente


antimicrobiano (s) revelo lo siguiente:. C =
63,54, H = 6.67, N = 7,29 y O = 21.7 Este
anlisis indica una frmula emprica sugerida
de C20H25N2O5.

La RMN- espectro

Reaccin bioqumica del


agente antimicrobiano

Las actividades biolgicas


del agente antimicrobiano

Identificacin del agente


antimicrobiano

4. Discusin
AZ-SH-29 se aisl de una muestra del suelo (medio almidn nitrato)

optimizacin de la biosntesis se estudiaron diferentes condiciones culturales tales como el pH, la


temperatura y perodo de incubacin, efecto de fuente carbono y fuentes de nitrgeno.

La biosntesis mximo se alcanz al final de un periodo de incubacin de cinco das para la produccin
de agente antimicrobiano.

rendimiento mximo del agente antimicrobiano se produjo al final de una temperatura de incubacin
de 30 C
efecto de diferentes fuentes de carbono y nitrgeno en la produccin del agente antimicrobiano
indicaron queStreptomyces ramulosus-AZ-SH-29 requieren glucosa y nitrato de sodio a
concentraciones 2.5.0 g / 100 ml;0,25 g / 100, respectivamente

metabolitos activos fueron extrados por acetato de etilo a pH 7.

Conclusiones:

caractersticas fsico-qumicas del antibitico purificada revelaron


que, su punto de fusin es 195 C.

soluble en cloroformo, acetato de etilo, Denso, n-butanol y ter


dietilio pero insoluble en agua, ter de petrleo, y hexano. estudio
del anlisis elemental del agente antibacteriano conduce a una
frmula impericade:C20H25O5N2