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Roteiro
Anexina V ou A5;
Apoptose;
Diagnstico clnico com ligao
de A5 em corpos apopttico;
Diagnstico in vivo;
O estudo;
Metodologias/Resultados;
Concluso
Anexina V (A5)
Protena anticoagulante encontrada na placenta humana, que
Apoptose
A apoptose um processo de morte celular ativo, mas silencioso, que ocorre em
externalizao de fosfolipdios mediada pelas caspases (cysteinedependent aspartate-specific proteases)(GRIVICICH, I; REGNER, A; ROCHA,A. B.,
2007)
Diagnsticos in vivo
Quando utiliza-se radionucleos como iodo-
ou regresso de carcinomas.
O estudo
Almeja o desenvolvimento de um processo eficiente e de alto
Metodologia
Cepas e Plasmdeos
A E. coli BL21 ( DE3 ) e C41 (
Metodologia
Clonagem molecular de rhanxa5
NM_001154.3 )
National Institute of Health ( NIH).
NdeI ( primer direto : 5 ' GCG CAT ATG GCA CAG GTT CTC AGA GGC ACT 3')
HindIII ( iniciador reverso : 5 ' GCG AAG CTT TTA GTC ATC TTC TCC ACA GAG C 3').
A sequncia do gene ANXA5 humano foi amplificado partir de uma amostra de
sangue humano .
Clonagem em
pCRBlunt
Amplificao de
AXNA5 por PCR
Metodologia
Sequenciamento automtico
Metodologia
Preparo dos meios
LB caldo lisogenia
Nomenclatu
ra
SD semi definido
Nomenclatu
ra
Component
es
(a,b,c,d,e),
(g)
e
(i)
foram
esterilizados em autoclave (30 min
121C);
(f) Foi esterilizado por filtrao;
(h) FeSO4 (2,8 g L-1), MnCl2 (2 g L1), CaCl2 (2 g L-1), CuCl2 (0,26 g L-1)
Fonte: As autoras (2015)
e ZnSO4 (0,3 g L-1);
Tudo foi misturado em condies
Preparo
NaCl 10 g L-1.
Preparo
Cultura em
de de
agitao
Aplicao
Para a alimentao
debalo
meio
culturas
em ambos os meios;
Metodologia
Cultivo em balo de agitao
Metodologia
SDS-PAGE
Quando necessita-se separar as protenas somente por tamanho,
utiliza-se a tcnica de SDS-PAGE (SDS Polyacrylamide Gel
Electrophoresis). O SDS um detergente aninico forte, que se liga
resduos positivamente
carregados
conferindopor
s
Aaos
eletroforese
uma tcnica
analtica das
queprotenas,
separa molculas
mesmas
uma carga final negativa e ocasionando a desnaturao.
carga
e tamanho.
Na eletroforese de protenas utiliza-se o gel de poliacrilamida, o qual
Metodologia
SDS-page
Fonte:
http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp
?id=810
Resultado
Clonagem e expresso
Fonte:
http://www.centrocienciajunior.com/miudos_graudos/vamosfalar01.asp
Metodologia
Inoculo para biorreator
Clulas
transformadas de E. coli
BL21(DE3) que contm o plasmdeo
recombinante pET-30a(+)::ANXA5
foram estocadas em 50% de glicerol
a -80C.
Fonte: ca.vwr.com
Metodologia
Espectrofotometria
Espectrofotometria Medida da absoro ou transmisso de luz.
Quando um feixe de luz monocromtica atravessa uma soluo com molculas
Fonte: www.ebah.com.br
Metodologia
Cultivo em biorreator
Fonte: www.sartorius.com
Metodologia
Mtodos analticos
O crescimento celular foi monitorado medindo-se densidade a ptica a 600
Metodologia
Gravimetria / anlise
de
glicose
Uma enzima especfica para
o
A anlise gravimtrica ou gravimetria,substrato de interesse imobilizada
duas
membranas:
um mtodo analtico quantitativoentre
cujo processo envolve a separao epolicarbonato e acetato de celulose.
O substrato oxidado quando
pesagem de um elemento ou um
composto do elemento na forma maispenetra na camada de enzima,
pura possvel.
produzindo perxido de hidrognio,
que passa atravs do acetato de
celulose a um elctrodo de platina,
onde o perxido de hidrognio
oxidado.
A corrente resultante proporcional
concentrao do substrato.
Fonte:
Metodologia
Cromatografia e HPLC
Metodologia
Cromatografia e HPLC
A amostra dissolvida em um solvente e
introduzida
na
coluna
cromatogrfica
preenchida com a fase estacionria.
Um solvente bombeado com vazo constante
e desloca os componentes da mistura atravs
da coluna. Esses se distribuem entre as duas
fases de acordo com suas afinidades.
As substncias com maior afinidade com a fase
estacionria movem-se mais lentamente. J as
substncias com pouca afinidade com a
movem-se mais rapidamente.
Ao sair da coluna, os componentes passam por
um detector que emite um sinal eltrico o qual
registrado, constituindo um cromatograma.
Fonte: waters.com/waters/nav.htm?
cid=10049055
Metodologia
Quantificao da produo de protena
Qubit Protein Assay Kit
Quantificao de DNA, RNA e protenas.
Dilui-se o corante no buffer fornecido e
adiciona-se a amostra. O resultado
fornecido pelo leitor.
Fonte: www.lifetecnologies.com
Fonte: www.b2b.invitrogen.com
Resultados
Mtodos analticos
Com 4 horas de cultivo, verificou-se que a glicose era totalmente consumida, o que
indica que este o tempo em que se deve iniciar a alimentao do biorreator.
Depois de 4 horas de batelada sem alimentao a concentrao de biomassa
alcanada foi de 4.71 g/L.
Com a induo do perfil linear de alimentao obteve-se uma concentrao de
biomassa de 26.01 g/L.
Foi induzida a expresso de rhANXA5 com a adio de IPTG. A mdia obtida foi de
28.48 g/L de concentrao de biomassa e 4.8 g/L de concentrao de protenas.
A mdia obtida no cultivo em Shaker foi de 0.615 g/L aps 6 horas de cultivo.
Resultados
Mtodos analticos
Em um biorreator independente foram realizadas densitometrias
das culturas para quantificar a rendimento da produo, o
rendimento especfico e a produtividade de rhANXA5. Os resultados
obtidos foram 1.95 g/L, 0.0715 e 0.065 g/L respectivamente.
Para o todo o procedimento (30 horas), desde o cultivo em
biorreator at a purificao, obtiveram-se 28.5 mg de rhANXA5
purificado (ou 0.983 g/L) e 0.0361 g/L de rhANXA produtivo.
Metodologia
Purificao
ANXA5 protena recombinante foi purificada utilizando uma
cromatografia FPLC - sistema KTA (GE Healthcare ).
Monitoramento por deteco UV a 215, 254 e 280 nm e as fraces
foram analisadas por 12% SDS-PAGE.
Clulas congeladas (3 g) foram suspensas em 30 mL de tampo A
(Tris HCl (50 mM ); CaCl2 (10 mM); pH 7,2) e incubadas com fenil
fluoreto de metanossulfonilo (1 mM) durante 30 min a 4 C.
As clulas foram rompidas por sonicao e centrifugado a
38.900rpm durante 30 min. O sobrenadante foi rejeitado e o
sedimento foi completamente dissolvido em 30 mL de tampo B
(Tris HCl (50 mM); EDTA (20 mM) pH 7,2), agitou-se durante 30 min
a 4 C, e clarificada por centrifugao a 38.900rpm durante 30 min
a 4 C.
Metodologia
Purificao
O sobrenadante foi dializado contra 20 mM Tris-HCl pH 8,0
Precipitado residual foi removido por centrifugao e o sobrenadante
foi carregado numa MonoQ HR 16/10 coluna de permuta aninica,
previamente equilibrada com 20 mM de Tris HCl pH 8,0.
A protena foi eluda com 25% de gradiente linear de 20 mM de Tris
HCl, 1 M de NaCl pH 8,0 a 1 mL min-1 Caudal.
RhANXA5 homognea foi eluida a aproximadamente NaCl 190 mM.
As fraes contendo rhANXA5 homognea foram reunidas, dialisadas
contra 20 mM de N-2-hydroxy ethyl piperazyne -N'-2-etanossulfnico
(HEPES), 100 mM de NaCl, pH 7,2 e concentrado usando uma
AMICON (Millipore Corporation, Bedford, MA, EUA) ultra- membrana
de filtrao (MWCO = 10 kDa), e armazenadas a -80 C.
A concentrao de protena foi determinada com Qubit Protein
Resultado
Purificao
Metodologia
Identificao de rhANXA5 por espectrometria de massa
Os preparados de rhANXA5 (1 nmol)
foram dessalinizados e submetidos a
degradao
proteoltica
usando
tripsina.
Os peptdeos resultantes foram
separados por cromatografia capilar,
usando uma coluna de 15 cm.
Os
peptdeos
separados
foram
analisados usando um espectrmetro
de massa hbrido LTQ-Orbitrap.
Fonte:
www.analticaweb.com.br
Metodologia
Identificao de rhANXA5 por espectrometria de massa
Metodologia
Determinao da massa molecular
Purificada rhANXA5 amostras foram dessalinizadas , reconstituda em acetonitrilo 50
% / MilliQ - gua 49 % / cido frmico a 1 % e directamente injectada utilizando uma
seringa de 500 uL ( Hamilton Company , Reno , NV , EUA) num modo esttico numa
fonte inica de electrospray IonMax .
Os parmetros de fonte de electropulverizao foram como se segue : modo de io
positivo , 4,5 kV de tenso aplicada fonte de electrospray , 5 unidades arbitrrias
(variao 0-100 ) de fluxo de gs bainha , 45,6 V de tenso capilar , 250 C de
temperatura capilar , e 238,8 V de tenso de tubo de lente .
Espectros completa (600-2000 m / intervalo z) foram coletados em um Thermo
Orbitrap Descoberta XL no modo de perfil usando o analisador ion trap linear (modo
ITMS ) . O espectro mdio foi processado com o software MagTran [25] para a carga
deconvolution estado.
Resultado
Determinao da massa molecular
Figura 3: Determinao da massa molecular rhANXA5 por espectrometria de massa. a) espectros ESI-EMTF de
rhANXA5 mostrando a distribuio estado de carga.B) valor determinado experimentalmente de 35804 da para a
massa molecular mdia rhANXA5 aps espectros.
Metodologia
FITC-anexina V
Para confirmar a capacidade de detectar clulas que
Fonte: lamed.ccb.usp.br
Citometria de Fluxo
A Citometria de Fluxo uma tecnologia rpida e precisa que mede e
analisa as propriedades pticas de um grande nmero de clulas ou
partculas separadamente. necessrio que as amostras a serem
testadas estejam em suspenso.
As amostras sero analisadas atravs da marcao por
imunofluorescncia com diferentes fluorocromos, os quais sero
excitados pelo laser.
O uso de fluorocromos com caractersticas diferentes de
fluorescncia, vrios lasers e vrios fotodetectores permite aos
citmetros de fluxo medir muitas caractersticas de cada partcula
simultaneamente, como dimetro celular, estruturas granulares no
interior das clulas e intensidade de fluorescncia.
Concluses
Cultivos em batelada alimentada representam uma alternativa para cultivos em
Shaker, permitindo o controle das variveis do processo, melhoria na concentrao
de biomassa e rendimento do produto.
Neste trabalho foram produzidas 28.5 mg de anexina V recombinante purificada,
obtida em 3 g de clulas hidratadas cultivadas em batelada alimentada.
A utilizao do marcador fluorescente para marcar anexina V e assim identificar as
clulas em apoptose est atualmente limitado a estudos histolgicos de triagem de
clulas realizados in vitro. A sua utilizao para exames de imagem in vivo
dificultada principalmente por questes de custo. Assim, a produo em larga
escala poder ampliar a utilidade comercial para rhANXA5, reduzindo custos e
permitindo um maior acesso as comunidades cientfica e mdica para este produto.
Referncias
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