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Breve historia sobre el DNA

1865
1865 Medel
Medel

1902
Boveri
y
1902
Boveri
y
proponen
proponen que
que los
los
hereditarios
hereditarios estn
estn
cromosomas
cromosomas

1910
confirma
1910
confirma
Teora
Teora cromosmica
cromosmica
de
de la
la herencia
herencia

Sutton,
Sutton,
factores
factores
en
en los
los

El experimento de Griffith (1928)

Primera evidencia de que el DNA


es el material hereditario

Principio
transforma
nte

Avery, Mcleod y Mccarthy (1944)

Retoman
principio
transformante
e
identifican DNA como
molcula
de
la
transformacin
bacteriana

Hershey y Martha Chase en 1952


Capa proteica

Trabajan con bacterifagos para


determinar cual es la causa de la
transformacin de la bacteria

DNA

Modelo de Watson y Crick

Propuesto en 1953
Describe como pareja de
hebras que se entrelazan
Cadenas
formadas
de
polinucletidos

Dos
Dos cadenas
cadenas de
de polinuecletidos
polinuecletidos enrollados
enrollados
sobre
sobre un
un eje
eje comn
comn
Las
Las bases
bases purina
purina y
y pirimidina
pirimidina estn
estn en
en el
el
interior,
interior, mientas
mientas que
que las
las unidades
unidades de
de fosfato
fosfato
y
y desoxirribosa
desoxirribosa se
se encuentran
encuentran en
en el
el exterior
exterior
Las
Las dos
dos cadenas
cadenas permanecen
permanecen unidas
unidas por
por
puentes
puentes de
de hidrogeno
hidrogeno
La
La adenina
adenina siempre
siempre esta
esta emparejada
emparejada con
con la
la
guanina
guanina y
y la
la citosina
citosina con
con la
la timina
timina

Importancia del ADN


Almacena la
informacin
gentica

Sntesis
Sntesis
proteica
proteica

Replicaci
Replicaci
n
n

Contiene la informacin para dirigir el


proceso
La secuencia de aminocidos esta
determinada por la secuencia de bases del
DNA

Caractersticas
hereditarias
transmitidas por transcripcin del
DNA

IMPORTANCIA
BIOLGICA DEL DNA

Informacin para sntesis de protenas


Replicar el ADN
Informacin gentica
Mutacin

REPLICACIN DE DNA

Proceso por medio del cual se sintetiza una

molcula de DNA utilizando como molde el


propio DNA celular.

Hiptesis de replicacin:

Extraccin de
DNA

El procedimiento bsico de la extraccin de


DNA se puede dividir en 5 pasos, algunos se
realizan simultneamente dependiendo del
protocolo a usar:
Ruptura de las clulas
Eliminacin de protenas
Eliminacin de RNA
Eliminacin de protenas
Concentracin de DNA

Lisis celular

Eliminacin de protenas
Enzimas proteolticas: proteinasa K.
Algunos protocolos utilizan para la lisis

celular el SDS en presencia de la


proteinasa K en un solo paso.
La digestin se acompaa de EDTA para
inhibir la accin de las ADNasas .
Organismos
ricos
en
protenas
(micobacterias y tripanosomas): despus
de la digestin se realiza un tratamiento
con bromuro de hexadecil-trimetil-amonio
(CETAB), que es un detergente catinico en
presencia de NaCl 0.7M.

El Ditiotreitol o DTT
Sirve para desproteger al ADN
Este reduce los puentes disulfuro de las

protenas
Muchas veces la reduccin de los puentes
disulfuro se da por una desnaturalizacin
esta puede ser a altas temperaturas, un
agente desnaturalizador como hidrocloruro
de guanidinio a 6M, urea 8 M o de
dodecilsulfato de 1%

Eliminacin de RNA
Digestin

del
RNA
con
ARNasas, como la ribonucleasa
A de pncreas de bovino.

En algunos protocolos se lleva

a
cabo
despus
extraccin del DNA.

de

la

Eliminacin de protenas
Solventes

orgnicos:fenol-cloroformo-alcohol

isoamlico
Fenol: bidestilado, equilibrado y protegido
contra la oxidacin mediante la adicin de 8hidroxiquinolina.
Cloroformo: se le adiciona alcohol isoamlico
(24:1), para prevenir la produccin de espuma

Concentracin de DNA
Precipitacin

con etanol en presencia de


cationes monovalentes a concentraciones de
0.1-0.5 M.

Se remueven residuos de fenol y cloroformo.


Sales: acetato de sodio, acetato de potasio,

acetato de amonio y cloruro de litio.

PROPIEDADES FISICAS Y QUMICAS DEL


ADN
Polmero largo formado por nucletidos.
Unidos por puentes de hidrgeno, mide 22 a 26 A .

Soluble en soluciones concentradas de


NaCl
Insoluble en alcohol
Puede ser disociado de la protena por el
tratamiento con un detergente o un fenol.

TARJETAS
WHATMAN
Las tarjetas FTA contienen
sustancias qumicas que lisan
clulas,
desnaturalizan
protenas y protegen los cidos
nucleicos de las nucleasas, del
dao oxidativo y el dao
causado por la radiacin UV.
Los cidos nucleicos quedan
capturados en la matriz de
celulosa de la tarjeta, los
detritos
celulares
son
eliminados con reactivo de
purificacin y agua libre de
nucleasas.

Whatman Ltd 2007-2009

Importancia del DNA obtenido


Diagnstico

prenatal
o
deteccin
de
portadores sanos de enfermedades genticas

Enfermedad de
Duchenne

Enfermedad de
Huntington
Drepanocito

Diagnstico molecular de las enfermedades

infecciosas

Estudio

de regiones polimrficas en ADN


humano conduce al desarrollo de tecnologa
para identificacin humana, como exclusin
de paternidad.

Criminalstica

Objetivo
Que

el alumno comprenda la importancia


biolgica de los cidos nuclicos y aplique sus
propiedades
fisicoqumicas
para
su
aislamiento a partir de diversos tejidos
biolgicos

Procedimiento para sangre


lquida
PASO
DESCRIPCIN
No.
1

LIMPIAR PERFECTAMENTE EL REA DE TRABAJO, USAR GUANTES Y


CUBREBOCAS, CERRAR LO QUE PERMITA LA CIRCULACIN DE AIRE (PUERTAS,
VENTANAS, ETC)

ETIQUETAR TUBOS FALCON DE 15 ML CON LA CLAVE CORRESPONDIENTE A LA


MUESTRA A TRABAJAR

COLOCAR 3 ML DE SANGRE EN EL TUBO FALCON ETIQUETADO

ADICIONAR 9 ML DE AGUA ESTRIL LIBRE DE NUCLEASAS

AGITAR POR INVERSIN DURANTE 1 MINUTO. PEDIR ASESORA PARA SABER SI


LOS ERITROCITOS SE LISARON.

CENTRIFUGAR A 3000 RPM DURANTE 10 MINUTOS. AL CABO DE ESTE TIEMPO,


DEBE OBSERVARSE UN PELLET BLANCO (LEUCOCITOS).

DESECHAR EL SOBRENADANTE CON SUMO CUIDADO PARA EVITAR LLEVARSE


EL PELLET CON LOS LEUCOCITOS Y EL DNA

AGREGAR A LA MUESTRA 2 ML DE UNA SOLUCIN QUE CONTENGA:


100 MICROLITROS DE PROTEINASA K 10 mg/ml
100 MICROLITROS DE DTT 1M
EN 800 MICROLITROS DE AMORTIGUADOR DE LISIS PROTEICA.
AGITAR EN VORTEX E INCUBAR A 65C DURANTE UNA HORA O HASTA OBSERVAR
LA LISIS DEL PELLET

10

AGREGAR 4 ML DE LA MEZCLA FENOL-CLOROFORMO-ALCOHOL ISOAMLICO CON


SUMO CUIDADO (TXICOS E IRRITANTES),TAPAR PERFECTAMENTE EL TUBO Y
AGITAR VIGOROSAMENTE DURANTE 10 MINUTOS

11

CENTRIFUGAR DURANTE 10 MINUTOS DE 3000-3500 RPM. PARA SEPARAR LAS


TRES FASES: UNA INFERIOR (ORGNICA. FENOL-CLOROFORMO-ALCOHOL
ISOAMLICO; OTRA INTERMEDIA, PROTENAS PRECIPITADAS Y UNA SUPERIOR O
ACUOSA CON EL ADN)
SEPARAR LA FASE ACUOSA Y COLOCARLA EN 10 ML DE ETANOL ABSOLUTO FRO
EN OTRO TUBO FALCON, TENIENDO CUIDADO DE NO REMOVER PROTENAS
PRECIPITADAS, PERO TRATANDO DE RECUPERAR AL MXIMO ESTA FASE ACUOSA,
YA QUE LA MAYOR PARTE DEL ADN SE ENCUENTRA MUY CERCA DE LA INTERFASE
AGUA-PROTENAS
MEZCLAR POR INVERSIN. EN OCASIONES ES POSIBLE OBSERVAR LA
PRECIPITACIN DEL ADN. SI EL PRECIPITADO SE OBSERVA BLANCO U
OPALESCENTE, SIGNIFICA QUE CONTIENE TODAVA MUCHAS PROTENAS, POR LO
QUE EL PROCESO DE PURIFICACIN FUE INEFICAZ
DEJAR EN CONGELACIN POR LO MENOS DOS DAS PARA PROMOVER LA
PRECIPITACIN DE LA MAYOR PARTE DEL ADN

12

13

14

15

CENTRIFUGAR A 3000 RPM DURANTE 15 MINUTOS Y DESECHAR EL ETANOL


ABSOLUTO

16

COLOCAR 2 ML DE ETANOL AL 70%

17

CENTRIFUGAR A 3000 RPM DURANTE 15 MINUTOS Y DESECHAR EL ETANOL AL


70%

18

DEJAR SECAR DURANTE 30 MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE

19

HIDRATAR CON 1 ML DE AGUA

20

LEER EN EL ESPECTROFOTMETRO:
260 nm: ABSORCIN DEL ADN
230 Y 280 nm: ABSORCIN DE ENLACE PEPTDICO Y AMINOCIDOS
AROMTICOS

21

OBTENER LA RELACIN DE LAS ABSORBANCIAS:


260/230 Y 260/280
INTERPRETACIN:
SI EL COCIENTE ES DE 1.8-2: ADN DE ALTA PUREZA
SI EL COCIENTE ES <1.8: ADN CONTAMINADO CON PROTENAS
SI EL COCIENTE ES >2: ADN CONTAMINADO CON FENOL

Procedimiento para FTA


PASO
DESCRIPCIN
No.
1
LIMPIAR PERFECTAMENTE EL REA EN LA QUE SE VA A TRABAJAR
CON HIPOCLORITO DE SODIO AL 5%
2

ETIQUETAR TUBOS EPPENDORF DE 1.5 ML


CORRESPONDIENTE A LA MUESTRA A TRABAJAR

CON

LA

CLAVE

COLOCAR 5 FRAGMENTOS DE 1.2 MM DE DIMETRO DE PAPEL FTA


CON LA MUESTRA DE SANGRE EN UN TUBO EPPENDORF DE 1.5 ML
PREVIAMENTE ETIQUETADO UTILIZAR EL HARRIS MICROPUNCHER

LLEVAR LAS MUESTRAS AL REA DE EXTRACCIN DE ADN Y


COLOCAR 400 MICROLITROS (8 GOTAS) DEL REACTIVO DE FTA A CADA
TUBO.

INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE Y AGITACIN (1000 RPM)


DURANTE 5 MINUTOS EN EL THERMOMIXER O POR INVERSIN

DECANTAR CON SUMO CUIDADO EL REACTIVO DE FTA, PROCURANDO


LIMPIAR EL REMANENTE DEL REACTIVO EN LA BOCA DEL TUBO CON
UN PAPEL ABSORBENTE LIMPIO

COLOCAR 400 MICROLITROS (8 GOTAS) DE AGUA DESTILADA ESTRIL


LIBRE DE NUCLEASAS A CADA MUESTRA

INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE Y AGITACIN (1000 RPM)


DURANTE 5 MINUTOS EN EL THERMOMIXER O MANUALMENTE

DECANTAR CON SUMO CUIDADO EL AGUA, PROCURANDO LIMPIAR EL


REMANENTE DEL REACTIVO EN LA BOCA DEL TUBO CON UN PAPEL
ABSORBENTE LIMPIO

10

COLOCAR 400 MICROLITROS (8 GOTAS) DE AGUA DESTILADA ESTRIL


LIBRE DE NUCLEASAS A CADA MUESTRA

11

INCUBAR A TEMPERATURA AMBIENTE Y AGITACIN (1000 RPM)


DURANTE 5 MINUTOS EN EL THERMOMIXER

12

RETIRAR EL AGUA CON UNA MICROPIPETA Y PUNTA DE 1000


MICROLITROS CON SUMO CUIDADO (O PIPETA PASTEUR)

13

COLOCAR LOS TUBOS A 60C DURANTE 30 MINUTOS, OBSERVAR QUE


NO QUEDEN RESIDUOS DE AGUA

14

LA MUESTRA EST LISTA PARA AMPLIFICARSE CON EL PROTOCOLO DE


PCR SET UP Y AMPLIFICACIN DE FTA CON TAQ GOLD O LA TAQ DE
PROMEGA

REFERENCIAS
Guyton A. Fisiologa mdica.11 ed. Madrid: Elevier,

2006.
Passarge. Gentica: texto y atlas: mdica
panamericana,2010.
Oliva R. Gentica mdica.3 ed, Barcelona: Ediciones
universidad ,2004.
Hernndez Chavarra Francisco, fundamentos de
epidemiologia: el arte detectivesco de la investigacin
epidemiolgica, San Jos, C.R: EUNED, 2002.
Orfila 4, IV jornadas anuales sociedad espaola
medicina legal y forense, Cdiz, Espaa: 1990.
Concepcin J Puerta B y Claudia P. Uruea P, practicas
de biologa molecular, Espaa: Editorial Pontificia
Universidad Javeriana.