CROMATOGRAFA

EN CAPA FINA

Antecedentes:
Fue creada por el botnico ruso
Michael Tswett en 1906, el cual
llam a su mtodo cromatografa,
palabra griega que significa
escritura a color, porque lo utilizo
para
separar
compuestos
coloreados.

Definicin
La cromatografa es una tcnica que
se emplea para separar entre si los
componentes de una sustancia.
Separacin, aislamiento, purificacin
e identificacin de sustancias, tanto
orgnicas como inorgnicas.

Tipos de cromatografa:
Segn al fundamento fsico-qumico en el
que se basa la separacin:

C. de adsorcin.
C. de reparto.
C. de cambio inico.
C. de filtracin molecular.
C. hidrofbica.
C. de afinidad.

Segn al material sobre el que

se lleva a cabo:

Cromatografa en papel.
Cromatografa de capa fina.
C. en columna.
C. de gases.

Aplicacin:
Se utiliza para la evaluacin, identificacin,
verificar pureza y para explorar los
parmetros de mtodos de cromatografa.
El uso de la cromatografa est ampliamente
extendido en el anlisis de alimentos,
medicinas, sangre, productos petrolferos y
de fisin radiactiva.

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

(CCF o TLC)
La cromatografa en capa fina es un caso
de cromatografa de reparto en la que los
componentes de una mezcla se separan
por diferencia de solubilidad entre dos
sistemas disolventes.

 La cromatografa en capa fina se basa en

la preparacin de una capa, uniforme de un
absorbente manteniendo sobre una placa de
vidrio u otro soporte.

La CCf presenta una serie de ventajas:

Resistencia a la temperatura
Resistencia a los reactivos agresivos de la
cromatografa en capa fina.
Mayor nitidez y sensibilidad de los
cromatogramas,
Mayor rapidez en su desarrollo.
Adems, los cromatogramas obtenidos
pueden conservarse indefinidamente y
archivarse.

 El mtodo es simple y los resultados son

fcilmente reproducibles lo que hace que sea
un mtodo adecuado para fines analticos.
si los compuestos separados no son
coloreados es necesario revelar la posicin
de dichos compuestos, para ello se emplean
determinadas sustancias conocidas como
reveladores entre los cuales el ms utilizado
es el Yodo

Tipos de cromatografa de
capa fina
Cromatografa en capa fina
cualitativa: Sirve para determinar los
distintos componentes de una mezcla.

Cromatografa en capa fina

preparativa: Sirve para separar y aislar a
los distintos componentes de una mezcla.
Se usan placas (20x20) de cristal.

Los requisitos
esenciales son:
Un adsorbente, placas de vidrio, un
dispositivo que mantenga las placas durante
la extensin, otro para aplicar la capa de
adsorbente, y una cmara en la que se
desarrollen las placas cubiertas.
Es preciso tambin poder guardar con
facilidad las placas preparadas y una estufa
para activarlas.
Es una tcnica simple en cuanto al
equipamiento necesario (placa y tanque
cromatogrfico) y de fcil desarrollo.

 Se puede utilizar como soporte cualquier

sustancia que pueda dividirse en partculas
finas y distribuirse uniformemente en forma de
lminas.
Esto incluye sustancias inorgnicas (gel de
slice, xido de aluminio, tierra de diatomeas,
silicato de magnesio, etc.) y orgnicas
(celulosa, poliamida, polietileno, etc.)
La utilizacin de soportes hidrfobos facilita la
separacin de compuestos no polares (lpidos,
por ejemplo).

 Se utiliza una placa recubierta con fase

estacionaria manteniendo un pequeo
espesor constante a lo largo de la placa.
Se usan lminas de: vidrio como soporte del
adsorbente, plstico (ej: acetato) metlicos
(ej: aluminio).
Los tamaos de la placa para CCf
convencional son: 20 x 20; 10 x 20 y 5 x 2 y
en algunos casos de micras de espesor.

 El tipo de fase estacionaria que se utilice en

un experimento depender del tipo de
molculas que se quieran separar.
ej: Hay placas que contienen un indicador
de
fluorescencia,
para
facilitar
la
identificacin de las muestras. Si no se usa
indicador y los componentes no son
coloridos se requerirn tcnicas de
revelado.

Fase mvil o eluyente:

El eluyente ascender, por capilaridad, por

la placa y arrastrar los componentes a lo

largo de sta produciendo manchas de los
componentes.
Debe encontrarse en un recipiente cerrado
(cmara de cromatografa) y en contacto con
la placa de cromatografa, asciende y arrastra
las sustancias a distinta velocidad segn la
mayor o menor retencin que experimenten.

La tcnica, en forma generalizada,

comprende:
* Preparacin del disolvente
* Preparacin de la cmara de
cromatografa
* Desarrollo del cromatograma
* Secado
* Revelado de las sustancias
separadas
* Estudio del factor de
retencin (Rf)

Adsorbentes, Eluyentes, soportes y

reveladores ms comunes para
cromatografa en capa fina.
Adsorbentes:

Al realizar la eleccin del adsorbente se

debe tener en cuenta el tamao de las
partculas del adsorbente, cuanto ms
finamente dividido est mayor ser su
adhesin al soporte, aunque tambin se
le puede aadir un adherente (yeso,...).

Algunos de los adsorbentes ms utilizados son:

Celulosa
Almidn
Azucares
Gel de slice (silicagel)
xido de aluminio (almina)
Carbn activo (carbn en polvo)

Los tres primeros se utilizan para extraer

componentes polifuncionales de plantas y animales.

Gel de slice (silicagel)

Uno de los ms utilizados

Su pH oscila entre 4-5, con lo cual no se
deber utilizar con sustancias que se
corrompan con los cidos.
Suelen contener impurezas de hierro y/o
aluminio, este factor tambin se debe tener
en cuentas respecto al uso de
componentes.

 El tamao del grano suele ser de 10 a 40

micras () y el tamao de poro vara de 20 a
150.
Generalmente lleva incorporado un agente
aglomerante, yeso para proporcionar firmeza
al adsorbente.
Tambin han sido incorporados dos
indicadores del ultravioleta, juntos o por
separados (amarillo y/o verde).

La almina u xido de aluminio

Adsorbente ligeramente bsico .
No consigue un desarrollo tan alto de la
sustancia depositada como el gel de slice.
Es tratada qumicamente para conseguir
alminas cidas, bsicas y neutras.
Puede
contener
aglomerantes
y/o
indicadores ultravioletas.
Es un adsorbente de carcter polar, de tal
forma que retendr con mayor avidez a los
componentes polares.

Eleccin del eluyente

Depender
lgicamente
del
componente que se
va a separar y del
material en que la
separacin se lleva
a cabo.

Principales Eluyentes en
orden creciente de
polaridad:
ter de petrleo.
ter dietlico.
Ciclohexano.
Acetato de etilo.
Tetracloruro de carbono.*
Piridina.
Benceno.*
Etanol.
Cloroformo.*
Metanol.
Diclorometano.
Agua.
cido actico.
*compuestos cancergenos.

En la eleccin del eluyente influyen varios factores:

Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de Eluyentes (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy voltiles.
Evitar que contengan trazas de metales
(catalizadores).
La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica.
Hay que estudiar la polaridad del componente y
probar con Eluyentes cada vez menos polares.

a) Toque de la muestra sin

aplicar ningn eluyente.
b) Aplicando un eluyente
poco polar.
c) Aplicando un eluyente
ms polar.
Al aplicar en primer lugar Eluyentes poco polares,
podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar
otros Eluyentes ms polares, hasta dar con el ms
apropiado.

Reveladores ms comunes para

cromatografa en capa fina
Las manchas de color son, por supuesto,
inmediatamente visibles; las incoloras pueden
revelarse mediante:
Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se
puede usar una fase estacionaria impregnada con
un indicador fluorescente (F254 F366), el
nmero que aparece como subndice nos indica la
longitud de onda de excitacin del indicador
utilizado.
La introduccin de la placa en vapores de yodo.

 El roco con una solucin de agua/H2SO4

1:1 (dentro de un compartimiento
especialmente protegido y bajo una
campana de extraccin de gases).
Despus calentar intensamente, por
ejemplo, con un mechero hasta
carbonizarlos compuestos.

Procedimiento para la realizacin:

1. Preparacin de las placas:
.El adsorbente se desle en agua destilada.
Para mezclar la papilla homogneamente
es preferible agitar de modo mecnico.
.La proporcin de adsorbente y agua
depende del tipo de adsorbente.

 Se utilizan como soporte del adsorbente,

lminas de vidrio y de compuestos orgnicos
ms flexibles.
Dependiendo del tipo de separacin que se
desee (cualitativa o preparativa) se utilizar
un tamao de placa u otro.
En la preparacin de las placas tambin se
pueden adicionar indicadores fluorescentes
o aglomerantes.

 El espesor de la placa es otro factor a tener en

cuenta al preparar la placa, en general suele
ser de:
0.1-0.2 mm. Para separaciones analticas.
0.5- 2 mm. Para separaciones preparativas.
Las placas, se dejan reposar un corto espacio
de tiempo despus de cubrirlas; luego se
colocan en bandejas metlicas. En este
momento puede activarse el agente
adsorbente.

2. Aplicacin de las muestras:

El proceso se realiza tocando con la punta del
capilar (micropipeta, jeringuilla, etc.) sobre la
placa preparada. Dejando una distancia al borde
inferior de un centmetro aproximadamente. El
punto de aplicacin de la muestra se denomina
toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para
evaporar el disolvente, de forma que en la placa
solo quedar la muestra a analizar.

3. Desarrollo

de CCf

se realiza normalmente por el mtodo

ascendente, esto es, al permitir que un
eluyente ascienda por una placa casi en
vertical, por la accin de la capilaridad.
La cromatografa se realiza en una cubeta.

 Generalmente el eluyente se introduce en la

cmara una hora antes del desarrollo, para
permitir la saturacin de la atmosfera.
El tiempo de una cromatografa cualitativa
suele ser de un par de minutos, mientras
que el tiempo de una cromatografa
preparativa puede llegar a un par de horas.

4. Localizacin de sustancias
Si los compuestos separados no son
coloreados es necesario revelar la posicin
de dichos compuestos, para ello existen
dos tipos de mtodos:
*Mtodos qumicos.
*Mtodos fsicos.

Mtodos qumicos :
Consisten en realizar una reaccin qumica entre un
reactivo revelador y los componentes separados.
Se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual
forma complejos coloreados con los componentes
orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las
manchas desaparecen con el tiempo con lo que es
conveniente sealar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador utilizado es el cido
sulfrico, que reacciona con los componentes
orgnicos produciendo manchas negras.

El tamao de las manchas no est relacionado

con la cantidad de componente separado.
Adems de estos reveladores generales, existen
otros especficos:
2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y
cetonas).
Verde de bromocresol (para cidos
carboxlicos).
Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
Ninhidrina (para aminocidos).

Mtodos fsicos:
Consiste en aadir al adsorbente un indicador
fluorescente.
Algunos
compuestos
poseen
cierta
fluorescencia (aunque no es normal) con lo
que pueden ser detectados directamente en
una lmpara de ultravioleta.

 Para calcular el valor de RF

De un compuesto
dado, se miden la
distancia recorrida
por este desde donde
se deposit en la
placa y la distancia
recorrida por el
disolvente. La medida
se realiza desde el
centro de la mancha.
Los mejores datos se
obtienen cuando las
manchas no superan
los 5 mm de
dimetro.

 Los datos ms importantes que

deben registrarse cuando se
estudia un cromatograma, son:
1) Adsorbente utilizado.
2) Espesor y grado de activacin de ste.
3) Disolvente utilizado para el desarrollo de
cromatograma.
4) Cantidad de muestra depositada en la placa.
5) Mtodo utilizado para detectar los
compuestos.
6) Valor de RF para cada sustancia.

Para la interpretacin de resultados se debe tener

en cuenta:
Las diferencias en los valores de Rf para cada una de
las sustancias, as como las formas de la mancha, tipo
de color e intensidad. A partir de la estructura qumica
hay que relacionar el mayor o menor valor de Rf con
la mayor o menor solubilidad en las fases estacionaria
y mvil.

Factores que influyen en una

separacin por CCf
Temperatura: a menor temperatura las sustancias
se adsorben ms en la fase estacionaria. La
cromatografa debe llevarse a cabo en un rea sin
corrientes de aire.
Limpieza de las placas. muchas placas
contaminadas con grasa o agentes plastificantes o
adhesivos, stas deben limpiarse corriendo primero
una mezcla de cloroformo y metanol y despus dejar
secar completamente antes de aplicar la muestra.
Pureza de los disolventes

Aparatos y materiales.
Generalidades
Cubeta cromatogrfica (con tapa hermtica); la mayora
de las veces se trata de la cubeta .Normal. (profundidad
del espacio para el gas: 3mm)
Placas de cromatografa: preparadas por uno mismo o ya
fabricadas.
Pipetas de microlitro.
Recipiente de vidrio con pulverizador.
Probeta o matraz Erlenmeyer con tapn (para preparar y
mezclar la fase mvil)
Secador.
Plantilla para TLC o regla.
En caso necesario: lmpara UV para comprobar la
fluorescencia o la disminucin de la misma.

GRACIAS