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Biotecnologia

Princpios e Processos

Objetivos
Conceitos
e
fundamentos
processos biotecnolgicos;
Obteno de Produtos

Vacinas
Anticorpos monoclonais
Biomateriais
Biomedicamentos

dos

O que BIOTECNOLOGIA?

Biotecnologia a utilizao de agentes

biolgicos

para

prover

bens

assegurar

servios.
Microbiologia, Bioqumica, Gentica,
Engenharia, Qumica, Informtica

Microrganismos, Clulas e Molculas


(Enzimas, Anticorpos, DNA, etc.)

CONHECIMENTO

AGENTES BIOLGICOS
BIOTECNOLOGIA

BENS

SERVIOS

Alimentos, Bebidas, Produtos


Qumicos, Energia, Produtos
Farmacuticos, Pesticidas, etc.

Purificao da gua, Tratamentos de


resduos, Controle de poluio, etc.

Biotecnologia Tradicional
T c ni ca s
Pr ocesso s F er me ntati vo e
En zi m ti co

Ap lic ae s
Di ve rsas Aplica es I ndu striais:
a ntibi ti cos, ci do s, l cooi s,
vi ta min as, a mino cid os,
al i mentos e be bi da s.

Fi xao Bi olgica de Nit rog nio

So ja , F ei jo

Cult ura de Te ci d os

Pr odu o de mu d as

Extr ao Biol gi ca

Pr odu o de va cinas, soro s e


bio f r ma co s (i n sulin as bo vina e
suna)

Biotecnologia Moderna
T nic as

Ap l ic ae s

DNA
Rec o mbi na nte

Ind ust ria Fa rmac euti ca: Prod uo d e


va c i na s, biof rma cos (i ns ul i na , ho rm nio
do c resc ime nto)
Ag ric ul t ura: Prod uo de se me nte s G Ms

Ant i co rpo
Mo nocl o na l

Sade huma na e a ni ma l: reag e nt es

Ge n mica

Sa de: Fa rmacog e n mi ca , T e rap ia


G ni ca
Ag ri c ul t ura: co mb ate a p rag as ( Est udos
d e ge no ma de fi topat ge no s)
Pe c u ria: p rod uti vida de, doe na s.

Biotecnologia
De acordo com a European Federation
of Biotechnology (EFB), a biotecnologia
engloba tanto a viso tradicional
quanto a biotecnologia molecular.
Para a EFB, a biotecnologia a
integrao das cincias naturais e
organismos, clulas, suas partes e
anlogos moleculares para produtos e
servios.

Histrico
Herbert Boyer
1969: Estudos com enzimas de
restrio de E. coli
Ataque stios especficos da molcula
de DNA;
Capacidade de unir duas fitas de DNA
de modo bastante preciso.

Histrico
Stanley Cohen
Estudos com molculas de DNA circulares
que localizavam-se livres no citoplasma
de certas bactrias: plasmdeos.
Replicao
independente
do
DNA
cromossmico;
Desenvolveu mtodos para a remoo dos
plasmdeos da clula;
Conseguiu inserir plasmdeos em outras
clulas;

Histrico
Boyer e Cohen
Combinaram os processos de uso de
plasmdeos e DNA recombinante (enzimas de
restrio).
Recombinao de segmentos de DNA com
determinada configurao;
Insero destes produtos em plasmdeos;
Introduo dos plasmdeos recombinantes em
bactrias;
Produo de protenas especficas;
Base da Biotecnologia.

Biotecnologia
Conjunto de tcnicas que utilizam organismos vivos ou
suas enzimas para produzir produtos e processos teis
ao homem.
Produo de po, coalhada, vinho (processos mediados por
microorganismos) esto relacionados biotecnologia.

Atualmente, a biotecnologia tem sentido mais restrito:


Conjunto
de
tcnicas
que
utilizam
organismos
geneticamente modificados (OGM) ou suas enzimas para
produzir produtos e processos em larga escala.

Muitos processos
biotecnolgicos:

podem

ser

classificados

como

Produo de genes sintticos em laboratrio;


Desenvolvimento de vacinas de DNA ou correo um gene
defeituoso;

Princpios da Biotecnologia
Duas tcnicas estabeleceram a biotecnologia
moderna:
Engenharia gentica e Biologia Molecular

Tcnicas que permitem o isolamento, manipulao e


introduo do material gentico de um organismo em
outro, hospedeiro, de modo a alterar seu fentipo.

Manuteno de ambiente livre de contaminao:

Permitir apenas o crescimento da clula desejada, em


grandes quantidades, para a obteno de produtos
biotecnolgicos, como antibiticos, vacinas e enzimas.

Biotecnologia
Vantagens das substncias obtidas:

No esto contaminadas;
So mais facilmente purificadas;
So mais especficas;
Produo em larga escala.

Desvantagens
produzidas:

das

substncias

Intervm de maneira permanente no meio


ambiente e na natureza intrnseca dos seres
vivos.

Transferncia Gnica
Transgnicos:
Seres que contm sequncia gnica de
organismos de espcie distinta.

Cisgnicos:
Seres que contm sequncia gnica de
outro organismo da mesma espcie, ou
entre
espcies
que
se
cruzam
naturalmente.

Engenharia Gentica

Tecnologia do DNA recombinante;


Clonagem gnica;
Transferncia gnica;
Introduo apenas do gene de
interesse;
No
transferncia
de
genes
indesejveis.

Engenharia Gentica
Etapas bsicas:
Identificao da sequncia gnica de interesse;
Isolamento/sntese do gene de interesse;
Insero
do
gene
em
um
vetor
de
transferncia/expresso;
Transferncia do vetor ao organismo alvo da
manipulao;
Transformao do organismo alvo;
Seleo dos organismos geneticamente modificados;
Manuteno do gene no OGM;
Habilidade do OGM de transferir o gene sua prognie

Clonagem Molecular
Obteno de mltiplas cpias de um
fragmento de DNA de interesse:
Fragmentao;
Amplificao;
Ligao;
Transfeco/Transformao;
Seleo;
Produo.

Plasmdeo: vetor de
clonagem
Caractersticas importantes:
Origem de replicao;
Stio de Mltipla Clonagem (MCS):
polilynker.
Enzimas de Restrio;
Marcador seletivo;

DNA ligase;
Capacidade de unir duas sequncias de
DNA.

Tecnologia do DNA recombinante


Ferramentas necessrias:
DNA recombinante
Enzimas de Restrio;
Eletroforese em gel;
Vetores de Clonagem;
Clonagem molecular;
Organismo hospedeiro competente;
Promoo da produo.

Tecnologia do DNA recombinante


Processos:
Isolamento do material gentico;
Clivagem stio-especfica do DNA;
Amplificao do gene de interesse;
Ligao do gene ao vetor de expresso;
Insero do DNA recombinante na clula
alvo;
Obteno

HISTRICO
Watson & Crick
Estrutura do
qumica do DNA
(1953)

Nature, 25 - Abr - 1953

Tecnologia DNA
recombinante
Insulina recombinante
(1978)

Ian Wilmut
clonagem de mamfero
(1997)

HISTRICO
PGH
Conhecer genoma H. sapiens
(1995-2003)

Transgenia
(1995...)

Prtica clnica
Testes genticos
(1995...)

Tecnologia do DNA recombinante


DNA: cido desoxirribonuclico (nucleotdeos)
Duas fitas complementares unidas por pontes de
hidrognio (ligaes de hidrognio) entre bases
nitrogenadas dos nucleotdeos.
Purinas: Adenina e Timina
Pirimidinas: Citosina e Guanina

Base exclusiva: timina (T).


Acar: desoxirribose
Nucleotdeos:
Acar
Ligao fosfodister
Base Nitrogenada
Grupo fosfato (carga negativa)

Tecnologia do DNA
recombinante
DNA recombinante:
Molcula de DNA formada pela ligao
de duas molculas de origens diferentes
(Ex. DNA de planta ligado a um
plasmdeo).

A engenharia gentica atua no nvel


molecular, onde as diferenas entre
espcies desaparecem.

Nucleases e Enzimas de
Restrio

Nucleases so enzimas que clivam a ligao


fosfodister entre os nucleotdeos
Desoxirribonucleases:
clivam
desoxirribonucleotdeos (DNAse);
Ribonucleases: clivam ribonucleotdeos (RNAse);
Exonucleases:
removem
nucleotdeos
das
extremidades do DNA;
Endonucleases: clivam em posies especficas
dentro da fita de DNA.

Endonuclease de restrio um tipo de


nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre
que identificar uma seqncia particular de
nucleotdeos que seja o stio de restrio da
enzima.

Nucleases e Enzimas de
Restrio
Enzimas
de
restrio
so
classificadas como endonucleases
stio-especficas, e so extradas de
procariontes.
Proteo contra infeco por
bacterifagos.

Enzimas de Restrio
Nomenclatura:
1 letra: gnero
2 e 3 letras: espcie da qual a enzima foi
extrada;
As 3 primeiras letras devem estar em
itlico.
Pode haver uma letra que indique a cepa
(strain);
Algarismos romanos ao final indicam a
ordem de isolamento das enzimas.

Enzimas de Restrio
Exemplo:
A enzima BamHI reconhece a seqncia
abaixo, na dupla fita de DNA.
Por reconhecer seqncia especfica de
nucleotdeos no DNA, atua como uma
verdadeira tesoura molecular.

Enzimas de Restrio
Outros exemplos:
BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H
5 G/GATCC 3

EcoRI - Escherichia coli R


5 G/AATTC 3

HaeIII - Haemophilus aegyptius


5 GG/CC 3

PstI - Providencia stuartii


5 CTGCA/G 3

Enzimas de Restrio
Stio palndromico:
Sequncia de DNA na qual a leitura da
fita direta (5-3) igual leitura da fita
reversa (3-5).

Enzimas de Restrio
Cortes possveis no DNA:

Vetores de Clonagem
So
ferramentas
utilizadas
para
promover a transferncia de material
gentico para uma clula hospedeira.
Tipos:
Plasmdeos: clonar fragmentos de at 9 kb.
Bacterifagos: clonar fragmentos de 9kb a
25 kb.
Cosmdeos: clonar fragmentos de 25 a 35
kb.

Plasmdeos
Molculas de DNA circular, fita dupla,
extracromossomais,
que
ocorrem
naturalmente em bactrias e algumas
leveduras.
Replicao independente que utiliza a mesma
maquinaria celular que realiza a replicao
cromossmica;
Geralmente
tem
grande
nmero
de
cpias/clula;
capaz de ser transmitido para as clulasfilhas.

Plasmdeos
Caractersticas:
Origem de replicao autnoma (ori):
Permite a replicao independente;

Marcador seletivo (amp):


Geralmente um gene que confere resistncia
antibiticos;
Auxotrficos permitem crescimento em meio mnimo.

Stio de mltipla clonagem (polylinker):


Contm stios de restrio nicos.

Gene reporter (LacZ):


Facilita o rastreamento e identificao dos clones bem
sucedidos.

Plasmdeos
Caractersticas:
Regio promotora:
Promove a expresso do gene de interesse.
Pode ser induzido por agentes externos

Screening:
Deteco da presena do DNA de interesse;
Anlise fenotpica. Ex.: colorao
(azul/branco)
Sequncia lacZda -galactosidase
Colnias brancas so clones bem sucedidos!

Plasmdeos
Esquema bsico de clonagem:

Clonagem Molecular
o isolamento e a propagao em
um
organismo
de
molculas
idnticas de DNA

Organismo Recombinante

Obteno do DNA a ser clonado;


Preparao do vetor;
Ligao do vetor com o inserto;
Transformao da bactria;
Seleo dos clones recombinantes.

Obteno do DNA a ser


clonado

Extrao de DNA;
PCR
Digesto
Purificao

Tecnologia do DNA
recombinante
Uso de PCR (reao em cadeia da
polimerase):
Amplificao do gene de interesse
Formao de material para a utilizao
nos processos de clonagem.

Eletroferese de DNA
Objetivo:
identificar
e
separar
fragmentos de DNA por tamanho a
partir do padro de migrao em
uma matriz.

Anlise via UV

Preparao do vetor de
clonagem

Ligao do inserto no
plasmdeo
Uso de DNA ligase

Extremidades
coesivas

Transformao bacteriana
Choque trmico:

Transformao bacteriana
Eletroporao:

Seleo dos clones


recombinantes

Construo do DNA
recombinante
Molcula de DNA de
um plasmdeo
circular

Molcula de DNA de um
plasmdeo linear com
extremidades coesivas

anelamento

Clivagem com
enzima de
restrio

Ligao covalente
pela DNA ligase
Insero em
uma clula
hospedeira

Molcula de DNA
plasmidial
contendo o
inserto

Expresso de Protenas
Recombinantes

Transformao
da E. coli

Cultura de
Clulas

Purificao
da Protena

Vacinas recombinantes
PRIMER F

1. PCR

Xb a

Primer R
I (4 )

Bam

LipL32 0906

HI (342)

Hin dIII (7 6 1)

lipL32
7 68 bp

L. interrogans

lipL32

2. Clonagens
pAE

3.
Multiplicao

pTARGET

E.coli (BL21)

Vetor
Plasmidia
l

Vetor
Plasmidi
al

pUS973
pUS974
pUS977

Vetor
Plasmidi
al

E.coli TOP10

Vetor
Plasmidia
l

Vetor
Plasmidia
l

Vetor
Plasmidia
l

Vetor
Plasmidi
al

E.coli TOP10

Vetor
Plasmidia
l

Vetor
Plasmidi
al

Vetor
Plasmidia
l

Vetor
Plasmidia
l

Vetor
Plasmidi
al

4. Vacinao
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmid
ial

Protena
Recombinante

Vacina de DNA

Vetor
Plasmid
ial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial

Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmid
ial

Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial
Vetor
Plasmi
dial

BCGr

Vetor
Plasmidi
al

Vetor
Plasmidia
l

Vetor
Plasmidia
l

Animais transgnicos

Plantas transgnicas

Anticorpos
Definio:
Glicoprotenas solveis produzidas por linfcitos B e
clulas plasmticas aps a estimulao por uma
macromolcula (antgeno).
Pertencem a um grupo de grandes polipeptdeos
chamados imunoglobulinas.

Funes:
Capacidade de se ligar ao antgeno atravs de foras
no covalentes (ligaes de hidrognio, atrao
eletrosttica e fora de van der Waals)

Estrutura:
Molcula com uma forma semelhante letra Y

Anticorpos e Biotecnologia
Produo de anticorpos: sensibilizao com
antgenos puros ou parcialmente purificados.
Anticorpos monoclonais:
Provenientes de clones de um determinado Linfcito B;
Se ligam somente um epitopo no antgeno;
Soluo especfica um determinado epitopo;

Anticorpos policlonais:
Mistura de anticorpos contra vrios epitopos;
Soluo inespecfica (ligantes em vrios epitopos)

Anticorpos conjugados/marcados:
Ligao covalente de marcadores molcula de anticorpo
por meio de Engenharia gentica.

Anticorpos Policlonais
Anticorpos provenientes de diferentes clones
de linfcitos B ativados pelo mesmo antigeno.
A injeo de anticorpos policlonais sob a forma
de vacinas, estimula o desenvolvimento de
vrias
populaes
de
linfcitos,
no
concentrando o esforo na produo do
anticorpo mais adequado e mais eficiente o
que leva a uma diminuio da sensibilidade e
eficincia da resposta imunitria;
Esta eficincia foi conseguida com a produo
de anticorpos monoclonais.

Anticorpos Monoclonais

Anticorpos Monoclonais
Vantagens:
No precisam ser purificados;
So especficos para um determinado eptopo.

Mielomas:
Clulas hbridas que resultam da fuso de um linfcito
B com um mieloma;
Clulas imortais com capacidade de produo de
anticorpos em grande quantidade
Formam culturas celulares permanentes (conferida
pelo mieloma);
Produzem anticorpos especficos para um s tipo de
antignio (conferido pelo linfcito B).

Anticorpos Monoclonais
Verificao da compatibilidade de tecidos e rgos para
transplantes e enxertos;
Combate rejeio de rgos:
Anticorpos monoclonais ligam-se aos receptores membranares
das clulas T, impedindo que estes detectem o rgo
transplantado;
Diminuio das defesas do organismo, para evitar uma rejeio
(pode provocar outras patologias)

Detectar a presena de molculas nos tecidos e nos


fluidos
Testes sorolgicos para identificao de microorganismos
causadores de infeces;

Diversos testes de diagnstico


substncias presentes na urina
Testes de gravidez

para deteco de

Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais utilizados no tratamento de
carcinomas;
Imunotoxinas:
reconhecem
determinadas
molculas
presentes em clulas cancerosas, provocam a sua
destruio sem afetar as restantes clulas.

Marcao de anticorpos monoclonais com marcadores


radioativos que se ligam aos antigenos da superfcie
das clulas cancerosas.
Imagem precisa do tumor e dos seus limites, para se fazer a
terapia adequada e localizada

Controlar certas doenas:


Utilizao de soro que contem anticorpos antitetnicos para
prevenir o desenvolvimento de ttano (desenvolvimento da
imunidade passiva)

Terapias
Frmacos produzidos em grande
escala e com recurso biotecnologia:
Antibiticos
Vitaminas
Biomateriais
Esterides
Biomedicamentos
Hormnios
Vacinas

Bioconverso/Biotransforma
o
A produo de molculas e
substncias feitas industrialmente.
Etapas:
Preparao do material;
Bioconverso;
Recuperao do produto

Exemplos:
Fermentao