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del DNA
Herramienta bsica
Endonucleasas (enzimas) de restriccin -> Enzimas de bacterias
que reconocen secuencias de DNA especficas y lo cortan por el
esqueleto azcar-fosfato.
Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de
reconocimiento (al azar)
Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son
repeticiones invertidas o palndromes
5-GGATCC- 3
3-CCTAGG- 5
EcoRI: E. Coli
BamHI: Bacillus amyloliquefaciens
Herramienta bsica
Clonacin del
DNA
DNA forneo (secuencia que
se desea clonar)
Vector de clonacin
(vehculo)
Vector
hbrido
Vectores
hbridos
(quimera)
C
l
o
n
a
c
i
Fragmentos de
distintas
procedencias que
se unen in vitro
tras cortarse con
la misma enzima
de restriccin.
Ligasa sella zona
hbrida
d
e Vectores de
l
clonacin
D
N
A
Plsmido (1 sitio
de corte) 2-15 kb
Fago
(Lambda)
Csmido
C
l
o
n
a
c
i
Vectores de
clonacin
Fago
Fago (2 sitios de
corte) < 24 kb
d
e
l
D
N
A
Cromosomas
artificiales P1
(derivados del
bacterifago P1,
pueden aceptar
insertos de 80 y 100
kb
Vectores de clonacin
C
l
o
n
a
c
i
Csmido
d
e
l
D
N
A
10
C
l
o
n
a
c
i
Husped: E. coli
Insercin del vector hbrido en el husped:
Plsmido: transformacin (solucin diluida
cloruro de calcio) y replicacin autnoma
Fago (transduccin, insercin en DNA
husped)
d
e
l
D
N
A
11
C
l
o
n
a
c
i
d
e
l
D
N
A
Fago : Insercin
en E. coli (slo se puede
Clonacin y secuenciacin del DNA
12
C
l
o
n
a
c
i
Un gen
Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene
intrones): uso de la transcriptasa inversa que
hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina
humana recombinante en bacterias)
Sntesis automatizada de DNA in vitro: a
partir de la secuencia aminoacdica se puede
hacer DNA con la ayuda del cdigo (no regin
promotora ni controladora de la expresin)
~100bp
d
e
l
D
N
A
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Vectores eucariticos
Resistencia a antibitico
(p.e., ampr)
Origen de replicacin
del DNA de levadura
(ARS)
Regin centromrica
(CEN)
Origen de replicacin
bacteriano (ori)
Linealizacin (con
endonucleasas) y adicin
de extremos telomricos
Telmero
ampr
ori
CEN ARS
Telmero
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Transfeccin:
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Mtodos transfeccin
Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA
forneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima
adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infeccin
viral)
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Mtodos transfeccin
Electroporacin: se usa corriente elctrica para
introducir DNA
Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesculas de
membrana artificial)
Biolstica (mitocondrias y cloroplastos): disparo de
proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA
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Poblacin de fragmentos
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Separacin fragmentos
Reptacin
de los
fragmentos
a travs del
gel de
agarosa
Dr. Antonio Barbadilla
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DNA teido
con bromuro
de etidio
emite
fluorescencia
con luz UV
Dr. Antonio Barbadilla
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Transferencia en
Southern
(esquema resumen)
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Mapas de restriccin
mediante
enzimas de restriccin
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24
La reaccin
en cadena
de la
polimerasa
(PCR)
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26
27
Secuenciacin
Usos de la PCR
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Secuenciacin de DNA
La secuencia nucleotdica exacta de un fragmento de DNA
permite un conocimiento ms completo de la estructura y
funcin de un gen.
La base molecular de mutaciones especficas
en un gen pueden investigarse
Las secuencias del DNA han revelado regiones
reguladoras comunes a todos los genes
La comparacin de secuencias de diferentes
especies provee estimas de las tasas de
evolucin molecular
Secuenciacin de genomas: estructura del
genoma
Disoxi
Mtodos:
Secuenciacin manual (inicial)
Qumico (Maxam y Gilbert 1977)
Didesoxi (Sanger 1977)
Dr. Antonio Barbadilla
Didesoxi29
30
31
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33
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35
36