BIOLOGA MOLECULAR

EN GINECOLOGA
Gustavo A. Sandoval, MSc.
gsandovalp@usmp.pe
Ginecologa y Obstetricia
2015-II

Flora Microbiana Humana

Microbiota Vaginal

Tcnicas en Biologa Molecular

Permite amplificar millones

de veces
Emplea nucletidos y
cebadores
Catalizada por una
polimerasa termoestable

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Componentes
Desoxinucleotidos (dNTPs) dATP, dTTP, dGTP, dCTP
Enzima Taq (Thermus aquaticus)
Iniciadores (Primers) Complementarios a la cadena de ADN
ADN molde Concentracion de 20ng

Desoxinucleotidos (dNTPs)

Bases Nitrogenadas del ADN

Union por puentes de hidrogeno
Adenina-Timina
Guanina-Citocina

ADN polimerasa

Estable a altas
temperaturas
Thermus
aquaticus

Thermococcus
litoralis

Enzima de 95kd.
Actividad
Exonucleasa: 53

Actuar altas temperaturas

PRIMERS
(Iniciadores, Cebadores)
Dos oligonucletidos que
son,
cada
uno,
complementarios a una de
las dos hebras del ADN.

nicos: Asegura alta especificidad:

5
3

5
3

3
CARACTERSTICAS
IMPORTANTES
nicos
Tamao
Dimeros de primers

5
La secuencia del extremo 3 es critica para el
funcionamiento

Etapas de la PCR

Temperatura

1. Denaturacin: Apertura de la doble cadena

2. Alineamiento: Anillaje de primers
3. Extensin: Generacin de la nueva cadena
100

Denaturacin

30 ciclos

94 oC

Extension
72 oC

50

50-60oC
Anillaje

Tiempo

Denaturacin
94 oC

El numero de copias del DNA delimitado por los

primers se duplica en cada ciclo de PCR
Numero de copias
1

16

32

64

Numero de ciclos

Electroforesis de ADN

Agarosa y su preparacin
Gel acta como filtro molecular, controlando la migracin en
funcin del peso molecular

Agarosa

Mezclar agarosa con una solucin

tampn como el TBE (tris-ac.
Borico-EDTA)

Calentar

Electroforesis
Separacin de molculas en un campo elctrico
Electrodo (+)

Cmara de electroforesis
Cubetas para preparacin del gel
de agarosa
Fuente de poder

Electrodo (-)

Tincin con Bromuro de etidio

Agente intercalante Bromuro
de Etidio
Molcula fluorescente que se
intercala entre las bases de la
molcula de ADN
Absorcin a 312 nm (UV)emisin
en luz visible

Tcnicas derivadas/basadas en PCR

PCR Nested :Amplificacin de una secuencia dentro
de otro previamente amplificada
PCR Multiplex :Varios targets diferentes en forma
simultnea
PCR-RFLP

:Polimorfismo gentico

Reverse Transcriptase-PCR

: Deteccin de mRNA

Real Time PCR :Cuantificacin de copias iniciales en

tiempo real

PCR Nested (anidada)

Dos rondas de amplificacin con diferentes pares de primers

1 Reaccin
Primers externos
para amplificacin
de una secuencia
extensa
2 Reaccin
Primers internos
para amplificacin
de una regin
especifica

SEGUNDA PCR

Genera mayor ESPECIFICIDAD

PCR Multiplex
Amplificacin de varias

secuencias de forma
simultanea
Diferentes set de primers
Tamao menor del amplicon

APLICACIONES
Ensayos de deleciones
Amplifica exones
Ensayos forenses
Biomarcadores polimrficos
Ensayos microbiolgicos
Cepas y especies

PCR en tiempo real (RT-PCR)

La tcnica RT-PCR combina la amplificacin del DNA con la deteccin de los

productos en un solo tubo.

Tiempo Real: Deteccin de productos de PCR en la medida que se van

generando
Monitoreando la amplificacin de una secuencia especifica en tiempo real
utilizando tecnologas fluorescentes

UTILIDADES
- Genotipificacin
- Cuantificacin de carga viral
- Cuantificacin del numero de copias de un gen
- Expresin gnica (RNA) Retrotranscripcin

Componentes RT-PCR

PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real

PCR
tradicional
Preparacin de
la Muestra

Amplificacin

PCR en
Tiempo Real

Preparacin de
la Muestra

Amplificacin y
Deteccin

Deteccin

Patgenos bacterianos detectados

Avances Recientes

Nmero de nios afectados: de

400,000 a

200,000 en 4 aos
Frecuencia Inicial durante gestacin, parto o
lactancia: de

15-45% a 1%