Microbiologa

QBP Martha Morales

Cristal de nieve visto

con microscopio
electrnico de barrido.

MICROSCOPIA

El microscopio de
Leeuwenhoek

Microscopio electrnico
de barrido

Para la observacin y estudio de objetos que no

son visibles a simple vista, es necesario
amplificar las imgenes. El instrumento que nos
permite hacer la amplificacin de objetos muy
pequeos es el:
MICROSCOPIO
Desde el punto de vista ptico , se reconocen dos
tipos de micr0oscopios, el que usa una lente
(llamado lupa) , que es el microscopio simple y
el que usa por lo menos dos lentes, el
microscopio compuesto, en este microscopio
la
imagen producida por la primera lente o sistema
de lentes (objetivo) es amplificada por la segunda
lente o sistema de lentes (ocular).

FUNDAMENTO
Para comprender el fundamento del microscopio,
es necesario conocer las propiedades de la luz.
La luz es una forma de energa que emiten
determinados cuerpos, despus de reflejarse
sobre otros cuerpos, la luz llega a nuestros ojos,
donde estimula a unas clulas especializadas y
enva al cerebro impulsos elctricos que nos
permiten ver la imagen que tenemos delante.
La luz se caracteriza por tener una longitud de
onda, que se relaciona con el color de la luz: a
cada color, le corresponde una longitud de onda.
La luz visible tiene un rango de que va desde
400 a 700 nm.

Propiedades de la luz
Reflexin. Cuando un rayo de luz que se propaga a travs de
un medio homogneo encuentra en su camino una superficie
bien pulida, cambia de direccin en el mismo medio,
cumpliendo las siguientes leyes:
1.-El rayo incidente, el rayo reflejado y la normal se
encuentran en el mismo plano.
2.- El ngulo de incidencia es igual al ngulo de reflexin.

Refraccin de la luz: Cuando un haz luz pasa de un

medio a otro, su trayectoria se dobla y cambia su
velocidad, ya sea vidrio u otro material transparente.
ndice de refraccin IR
El IR es una medida de la capacidad de refraccin, este
valor es igual a:
Sen 1 (ngulo de incidencia
IR
i)
=
-------------------------------Sen 2 (ngulo de refraccin
r)

Difraccin de la luz.
Desviacin de los rayos luminosos cuando encuentran un
obstculo al atravesar una rendija.

Lentes
Si se pule adecuadamente una lente, se
puede conseguir que todos los rayos que
provengan de un determinado punto
converjan en un nico punto al otro lado de
la lente. En este caso la lente se llama
convergente y sus dos caras son
convexas.
En el caso de que las dos caras sean
cncavas, la lente se llama divergente.

LENTE CONVERGENTE (Positiva) . Es aquella en la que al atravesarla un

conjunto de rayos paralelos, hace que stos converjan. Son convexas.
LENTE DIVERGENTE (Negativa). Es aquella que hace divergir un conjunto
de rayos paralelos. Una de sus caras al menos es cncava.

El haz luminoso procedente de la lmpara pasa

directamente a travs del diafragma al condensador,
debido al sistema de lentes que posee el condensador,
la luz es concentrada sobre la preparacin a observar.
El haz de luz penetra en el objetivo y sigue por el tubo
hasta llegar al ocular, donde es captado por el ojo del
observador.

Caractersticas del microscopio

Poder de resolucin. Capacidad para
discernir entre dos puntos muy cercanos.
El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2
mm es decir que para ver dos objetos
separados estos deben estar como mnimo a
esa distancia.
AN. Apertura numrica. Es una medida de la
amplitud del cono luminoso.
Distancia mecnica. Es la distancia que
recorre la luz por el interior del microscopio
desde que penetra por el objetivo, pasando por
los tubos y espejos hasta llegar al ocular.

La caracterstica ms importante de un microscopio es

su poder de resolucin, es decir la capacidad de
distinguir dos objetos cercanos como entidades
diferentes.
El lmite de resolucin es la distancia mnima a la
cual dos objetos pueden estar separados para ser
percibidos como objetos distintos y depende de la
longitud de onda de luz usada y de la apertura numrica

(AN), en base a la siguiente ecuacin:

Lmite de resolucin

-------2 x AN

El valor de AN se expresa segn la ecuacin:

sen
AN = -------2

= longitud de onda
de luz

=
ndice
de
refraccin
sen
= apertura

De estas ecuaciones, se puede deducir que:

a)A mayor AN o menor mayor poder de
resolucin (lmite de resolucin menor)
b) Debido a que el aceite de inmersin
tiene un ndice de refraccin mayor que el
aire e igual al del vidrio, mejora el valor de
AN.
El aumento total (AT ) que se puede alcanzar
con un microscopio compuesto depende de la
combinacin del ocular ,tubo del ocular y
objetivo que se utilice segn la relacin:
AT= AUMENTO DEL OBJETIVO x AUMENTO DEL
OCULAR x AUMENTO DEL TUBO DEL OCULAR.

Aberracin cromtica
Se origina debido a que la luz no es
monocromtica. Los distintos colores de la luz
tienen distintas velocidades dentro del
material de las lentes y por lo tanto distinto
ndice de refraccin. Cada color tiene un foco
distinto y experimenta diferente desviacin.

La aberracin esfrica
Es un defecto de las lentes en el que los rayos de
luz que inciden paralelamente al eje ptico, son
llevados a un foco diferente que los rayos prximos al
mismo

El microscopio ptico es un aparato capaz de

modular la energa luminosa, y que amplifica
la imagen permitiendo la observacin de
mayores detalles de los microorganismos.

El microscopio ptico est formado por 3 sistemas:

PTICO, LUMINOSO Y MECNICO.
OPTICO
Ocular. Es la lente situada cerca del ojo del
observador, parte ptica final externa, a travs del
cual se obtiene una imagen final, tiene aumento
propio (10 X). Permite ajustar las dioptras.
Tubo. Es la parte ptica - mecnica, situada en la
parte superior del microscopio, ste puede ser
monocular o binocular, (diseado con una distancia
mecnica fija de 160 mm y un aumento de 1, 25 X).

Objetivos. Son los lentes que captan la

imagen a observar, estn construidos por
cristal, tienen aumento propio y apertura
numrica.

Tubo Binocular. Cada uno de los tubos

contiene en el interior un sistema de primas
y espejos que dividen el haz de luz en dos
haces, cada uno enva por separado a cada
tubo. Estos tubos se deslizan hacia los lados
para ajustar la distancia inter-pupilar.

4
1
1.-Lado superior izquierdo indica el nmero de
aumentos.
2.-El lado superior derecho la apertura
numrica
3.-El lado inferior la distancia mecnica
4.-El lado inferior derecho el espesor del
cubreobjetos
El anillo inferior indica en que medio se hace la

Anillo de color
superior indica los
aumentos

El anillo inferior indica en

que medio se hace la
inmersin del objetivo

Anillo superior del

microscopio

Anillo inferior del

microscopio

Equivalencia entre los

aumentos y anillos de
colores

Colores que indican en qu medio

se debe hacer la inmersin

Aumento Color del anillo

s
superior

Carct
er

Sustanci
a

ndice de
refraccin

Color
del
anillo

Oil

ACEITE

1,515

Negro

1,333

Blanco

1.0 X

NEGRO

2.5X

PARDO

4.0X

ROJO

AGUA

10X

AMARILLO

Glyz

Glicerina 1,455

Naranja

16X

VERDE CLARO

25X

VERDE
OBSCURO

Metilen
o

Yoduro
1,740
de
metileno

amarill
o

40X

AZUL CLARO

100X

BLANCO

Vaco IR 1.0 , Aire IR

1.0002

SISTEMA

OPTICO

PARTE

FUNCIN

OCULAR

CONJUNTO DE LENTES DE
AUMENTO QUE
COLECTAN,ENFOCAN Y
ENVIAN LA LUZ AL OJO
DONDE SE FORMA LA
IMAGEN VIRTUAL

OBJETIVOS

SISTEMA DE LENTES DE
AUMENTO, PUEDEN SER
SECOS O DE INMERSIN EN
ACEITE

TUBO

PARTE OPTICA-MECNICA ,
PUEDE SER MONOCULAR O
BINOCULAR

SISTEMA

LUMINOSO

PARTE

FUNCIN

LMPARA (6 V)

FUENTE DE LUZ

DIAFRAGMA DE
CAMPO

REGULA LA CANTIDAD DE
LUZ QUE SALE DE LA
LMPARA

CONDENSADOR
(LENTE FRONTAL,
DIAFRAGMA DE
IRIS Y LENTE
AUXILIAR)
FILTRO

SISTEMA DE LENTES
CONVERGENTES QUE
CONCENTRAN LOS RAYOS
LUMINOSOS
SELECCIONA LA LONGITUD
DE ONDA DE LA LUZ

PARTE
BASE O PIE

FUNCIN
SOSTIENE EL APARATO

BRAZO O ESTATIVO

SOSTIENE LA PARTE PTICA

Y PERMITE SU TRASLADO
SOSTIENE LA PREPARACIN
O PORTAOBJETOS
SUJETA A EL PORTAOBJETOS

PLATINA
MECNICO

PINZAS
TORNILLOS
MACROMTRICO Y
MICROMTICRO
TUBO DEL OCULAR
REVOLVER

ACERCAN O ALEJAN RPIDA O

LENTAMENTE EL OBJETO Y EL
SISTEMA PTICO
SOSTIENE LA LENTE DEL
OCULAR
DISPOSITIVO GIRATORIO QUE
SOSTIENE Y PERMITE EL
CAMBIO DE LOS OBJETIVOS.

Aument Lmite de
o
resoluci
mximo n (nm)
til (X)

Aplicaciones
en Microbiologa

Campo
luminoso

1 500

100-200

Usado con objetos

teidos

Campo obscuro

1 500

100-200

Para m.o. vivos o

difciles de teir

Ultravioleta

2 500

100

Para obtener mayor

aumento y resolucin

1 500

100-200

Para objetos con

fluorescencia natural
o de tincin, til en
identificacin.

Contraste de
fases

1 500

100-200

Para ver estructuras

de m.o. vivos, sin
teir.

Confocal

1 500

100-200

Permite ver imgenes

en dos o tres
dimensiones.

Tipo de
microscopio

LUZ

fotone Fluorescencia
s

Aumento
mximo
til (X)

Lmite
Aplicaciones
de
en
resoluci Microbiologa
n (nm)

Barrido

15 000 a
100 000

100-200

Para estructuras
superficiales con
una imagen
tridimensional

Transmisin

6000 a
400 000

1 10

Para observar
organelos y
ultra-estructuras
de
microorganismos
.

1 000 000
a
100 000
000

0.1 - 1

Observacin de
macro-molculas
y tomos.

Tipo de microscopio

ELECTRNICO
Haz de
electrones

EFECTO TNEL

Medidas de algunas clulas, bacterias, virus,

molculas y enlaces.
Paramecium sp

150 a 300 m

Eritrocitos humanos

7 m

Amibas

50 a 300 m

Saccharomyces cerevisiae

6 a 8 m

Candida albicans

2,5 x 6 m

Bacillus subtilis

0.8 x 2,5 m

Staphylococcus aureus

0.5 x 1.0 m

Escherichia coli

0.7 x 1.0 m

Virus de hepatitis A

24 x 29 nm

Membrana citoplasmtica

70

Bacterifago

20 a 80 x 20 a
nm

Albmina

100-800

Glucosa

500

Microscopio electrnico (1925-1930)

Utiliza electrones para formar imgenes (can de
electrones)
Lentes magnticas Se realiza al alto vaco
Muestra deshidratada
Imagen se forma sobre una
placa
fotogrfica
Microscopio
electrnico de transmisin
La
imagen
observa endirigidos
blanco yhacia
negroel objeto a
Emite un haz deseelectrones
observar. Una parte de los electrones rebotan o son
absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando
una imagen aumentada de la muestra.
La muestra debe cortarse en capas finas, no mayores de
un par de miles de Armstrongs.

Microscopio electrnico de barrido

La muestra es recubierta con una capa de metal
delgado, y es barrida con electrones enviados desde un
can. Un detector mide la cantidad de electrones
enviados, y
muestra figuras en tres dimensiones,
proyectados en una imagen de TV. Su resolucin est
entre
3 y 20
del
Granos
de nm, dependiendo
Ovocito
delmicroscopio..
camarn de roca con dos
polen

espermatozoides
fecundando

que

lo

estn

Imagen de los pelos de un abejorro, polvo en las puntas. El abejorro fue

desecado y cubierto por un delgado film de oro. 1024 x 800 pixeles

Cuidados del microscopio

1.- Transportar el microscopio en forma vertical, tomndolo
del brazo con una mano y de la base con la otra.
2.- Colocar con cuidado el microscopio sobre la mesa de
trabajo. Cuidar que no existan vibraciones o aparatos que
las provoquen sobre la mesa (vortex, agitadoras, etc.)
3.- Limpiar el soporte mecnico del microscopio con una tela
que no deje pelusa y la parte del sistema ptico exterior con
papel seda.
JAMS LIMPIAR LAS LENTES CON SOLVENTES ORGNICOS.
4.- Evitar arrastrar, golpear o inclinar el microscopio.
5.-No limpiar con el dedo el aceite de inmersin.
Al terminar de hacer las observaciones, limpiar el
microscopio como se indic y entregarlo:
Con la lmpara apagada , el cable enrollado y sujeto con una
liga
Con la platina hasta el tope inferior
Con el revolver colocado en el objetivo de menor aumento .

Glosario
DIOPTRAS: es la medida con la que se estima el poder
de un lente, mientras ms dioptras tenga un lente mayor
ser la capacidad de hacer convergencia o divergencia
de la luz.
DISTANCIA INTER-PUPILAR . Es la distancia existente
entre la pupila del ojo derecho y la del ojo izquierdo.
Pixel.Unidad bsica de una imagen digitalizada en
pantalla a base de puntos de color o en escala de grises
1
1000
1000000
10000000

Milmetro
Micrmetros
Nanmetros
Armstrong

TELESCOPIO
HUBBLE

GALAXIA DEL SOMBRERO M104

A 28 millones de aos luz
de distancia .