ELECTROFORESIS DE

PROTENAS Y CIDOS
NUCLECOS

ESTRUCTURA DE
AMINOACIDOS
carboxyl group

amino group

side chain

-carbon

Aminocidos cidos
Contienen al grupo carboxilo
Presentan carga negativa al pH fisiolgico, se presentan
como base conjugada
Aspartato (Asp, D)

Glutamato (Glu, E)

Aminocidos bsicos
Contienen bases nitrogenadas hidroflicas
Cargados positivamente a pH fisiolgico
Histidina (His, H) Con un anillo imidazlico
protonado/ionizado, es el nico aa que funciona como
tampn en el rango de pH fisiolgico.
Lisina (Lys, K) Es un diamino-cido, protonado a pH 7.0
Arginina (Arg, R) Con el ion guanidino siempre
protonado, es el aminocido ms bsico.
H

H+

pKa 6.0

+:

Curva de Titulacin para la Ala

pK1 acido carboxlico= 2
pK2 grupo amino = 10
pI = (pK1+ pK2)/2

pI (punto isoelectrico) = Valor de pH en el cual el nmero de cargas

positivas en la poblacin de moleculas es igual a las negatvas (carga neta cero)

Formacin del puente Peptidico

Naturaleza de doble enlace del pte. peptdico

Alfa Hlice
Residuos por vuelta:
Right handed 3.6
helix
Alcanze por residuo:
1.5 Angstroms

Alcanze por vuelta:

3.6 x 1.5A = 5.4
Angstroms
El Hidrogeno del
amino forma un pte
de H con el oxigeno
del Carbonilo
localizado a 4 aa
arriba y forma una
vuelta con 13 atomos

Hojas Beta-plegada
Las hojas Betaplegada se forman
de multiples cadenas
beta lado al lado.
Pueden ser paralelas
o antiparalelas
La hoja Beta
antiparalela es la
ms estable

Estructura 3
Plegamiento espacial de toda la cadena
polipptidica

Estructura 4o
Describe la organizacin de subunidades en una
protena con subunidades (protena oligomrica)
Pueden tener homo-multmeros o hetero-multmeros

22
2

Curva de Titulacin de un Tetrapeptido

+H3N-Glu-Gly-Ala-Lys-COO-

PI de las
protenas

Estructura de Acidos Nuclecos:

DNA

Electrofororesis
El transporte de molculas cargadas a
travs de un soporte, cuando son
sometidas a un campo elctrico, recibe
el nombre de electroforesis.

Conceptos fundamentales

La fuerza que determina la migracin de

las molculas en la electroforesis es
proporcional a la magnitud del campo
elctrico y a la carga.

Electroforesis
En el momento que se aplica el campo elctrico
E, la accin de la Fe har que la partcula se
acelere. Esta Fuerza depende de la carga de la
partcula y de la magnitud del Campo elctrico
E (V/cm)

Fe= q E

Cuando la partcula empieza a moverse por

accin de la fuerza elctrica se manifiesta un
fuerza que se opone al movimiento, la fuerza
de Rozamiento.

Electroforesis
Fr= f v
Donde: f, es el coeficiente de friccin y
v, la velocidad de la partcula.
Si asumimos que la partcula es esfrica,
se puede aplicar la siguiente formula:
f= 6r
Siendo , la viscosidad del medio, y r, el
radio de la partcula.

Electroforesis
Entonces tendramos:
Fr = 6rv
Cuando las fuerzas de friccin se igualen a las
fuerzas elctricas, a partir de ese momento
las fuerza neta sobre la partcula ser nula y
se alcanzar un estado estacionario en el que
la partcula se mueve a velocidad constante.
Fe = Fr
Tenemos as:
entonces

Eq = 6rv

Electroforesis
Podemos definir a la movilidad
especfica electrofortica de una
partcula a la velocidad que toma por
unidad de campo electrico = v/E
De la ecuaciones anteriores, tenemos
= v/E =
q
6r

Electroforesis

Como es el circuito elctrico en una

Electrofororesis?

Electroforesis
En el Circuito Elctrico: los cationes se
trasladan hacia el Ctodo(-) y los anines
hacia el nodo (+) a velocidades que
dependen del equilibrio entre la fuerza
impulsora del campo elctrico sobre los
iones cargados de la muestra y las
fuerzas de retardo entre las molculas
migrantes y el medio circundante
(fuerzas de friccin y electrostticas)

Electroforesis
Las tcnicas electroforticas son
utilizadas para separaciones efectivas ,
resolucin de mezclas de protenas para
su anlisis y caracterizacin posterior,
as como para anlisis de pureza.

Que se necesita para realizar una

electroforesis?

La muestra (protenas)
Solucin tampn
Medio de soporte
Sistema o Cmara de Electroforesis
(Horizontal o Vertical)
Reservorio para el buffer y para el soporte
Los electrodos asociados (Anodo y Ctodo)

Un fuente de Poder

Electroforesis
Es importa notar: La corriente entre los
electrodos es conducida tanto por la
muestra como por los iones del buffer,
mientras que la corriente en el resto del
circuito es conducida por electrones.
La corriente se mantiene por todo el
circuito al tener lugar la electrolisis del
H20 en los electrodos (que se
encuentran en contacto con el buffer)

Electroforesis
H2O

Anodo (+)
2H+ + O2 + 2e-

Ctodo (-)
2e- + 2H2O
2OH- + H2

Electroforesis
Los OH- producidos en el ctodo incrementan
la disociacin del cido dbil HA del buffer, lo
que provoca la formacin de ms iones A(base conjugada), que conducen la corriente
hacia el nodo. En el nodo los iones A- se
combinan con los iones H+ formando HA y
finalmente los electrones alimentan el circuito
elctrico.
HA

H+ + A-

Factores que influyen en la movilidad

electrofortica de una partcula
Caractersticas de la muestra
Carga (q)
Tamao
Forma

Campo Elctrico (E)

Intensidad de corriente (I)
Voltaje (V)
Resistencia (R)

Factores que influyen en la movilidad

electrofortica de una partcula
Caractersticas del buffer o tampn
Composicin ( Tris?, MOPS?)
Concentracin (fuerza inica 0.05 -0.015)
pH

Interaccin con el medio de soporte

Adsorcin
Electroosmosis
Tamizado molecular o tamao de poro

Electroforesis
La corriente entre los electrodos es
conducida tanto por la muestra como por
los iones del buffer, mientras que la
corriente en el resto del circuito es
conducida por electrones.

Electroforesis
Tipos de soportes utilizados:
Papel
Acetato de celulosa
Geles:
Almidn
Agarosa
Poliacrilamida

Tipos de Soporte en Electroforesis

1) PAPEL. Es una malla de fibras de celulosa. Es un soporte poco
restrictivo, pero es difcil de obtener en tamaos de poro y
espesores totalmente homogneos. Desventajas: las
macromolculas se adsorben a las fibras de celulosa, lo que da
lugar a artefactos y separaciones defectuosas. Se empleaba
fundamentalmente para molculas pequeas, como pptidos y
aminocidos.

2) ACETATO DE CELULOSA. Este derivado de la celulosa
forma un gel de poro grande, muy poco restrictivo para las
protenas de tamao corriente. A diferencia del papel, es inerte
frente a la mayor parte de las protenas y se puede conseguir en
lminas de caractersticas estructurales constantes y definidas.
Es de fcil manejo, costo relativamente bajo y con alta
reproducibilidad se utiliza en laboratorios de anlisis clnicos
(para el anlisis de protenas sricas).

Tipos de Soporte en Electroforesis

3) ALMIDON. Se emplean geles formados
con almidn parcialmente hidrolizado. El poro
es menor que para el caso del acetato de
celulosa, y se suelen obtener mejores
separaciones que con ste ltimo, ya que la
difusin es menor. Sin embargo, han sido
sustituidos por geles de poliacrilamida debido
a la dificultad que supone el obtener
resultados reproducibles empleando un
producto de origen natural.

Tipos de Soporte en Electroforesis:

Geles de Agarosa
El Agar-agar es un polmero de origen natural
que se extrae de determinadas algas rojas,
por ejemplo de Gelidium.
El agar natural se puede fraccionar mediante
precipitacin selectiva en dos constituyentes,
uno relativamente libre de sustituyentes
aninicos, conocido como agarosa, y una
fraccin rica en dichos sustituyentes que es
la agaropectina.
En Electroforesis se emplea exclusivamente la
Agarosa.

Tipos de Soporte en Electroforesis:

Geles de Agarosa
La Agarosa : Es un polmero lineal formado
por la repeticin de unidades del disacrido
agarobiosa, cuya estructura es:
-(1-3)-b-D-Galactosa-(1-4)[3,6 anhidro]-a-Lgalactosa
Las cadenas resultantes son de longitud
elevada. Se ha estimado que su peso molecular
medio es del orden de 120000, es decir,
alrededor de unas 400 unidades del disacrido
fundamental. Puede presentar grupos sulfato,
piruvato

Tipos de Soporte en Electroforesis:

Geles de Agarosa

Tipos de Soporte en Electroforesis:

Geles de Agarosa
La Agarosa forma geles termoreversibles en
agua o en soluciones salinas, de consistencia
notable incluso a muy baja concentracin del
polmero: es posible formar geles
mecnicamente estables con tan slo un 0,4%
en peso de agarosa en agua.
El proceso de gelificacin ocurre a
temperaturas relativamente bajas. Por
ejemplo, la Agarosa M (Amersham
Biosciences) presenta una temperatura de
gelificacin (una vez disuelta en agua) de 4043C, y una temperatura de fusin de 90C.

Tipos de Soporte en Electroforesis:

Geles de Agarosa

Tipos de Soporte en Electroforesis

5) POLIACRILAMIDA. El gel se forma "in
situ" por la polimerizacin de una disolucin del
monmero. Es posible controlar el tamao del
poro de una forma muy reproducible.
Es el tipo de gel ms empleado para la
electroforesis de protenas de tamao
comprendido entre 10.000 a 250.000 D, y de
otras molculas de tamaos similares,
incluyendo cidos nucleicos de cadena corta
La tcnica se conoce como PAGE (acrnimo de
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis).

Tipos de Soporte en Electroforesis:

Poliacrilamida
Ventajas de los geles de poliacrilamida

Son bsicamente inertes

Pueden prepararse con una gran variedad de
tamao de poro
Pueden usarse con una amplia variedad de
buffers
Proporcionan una separacin rpida
No tienen absorbancia a 270 nm
Permiten una adecuada tincin de las
macromolculas una vez separadas

Tipos de Soporte en Electroforesis:

Poliacrilamida
Se forman mediante la polimerizacin de
acrilamida/BIS en una disolucin que contiene
el monmero, catalizadores de la
polimerizacin y un tampn al pH deseado; se
pueden aadir aditivos como detergentes o
urea.
La polimerizacin se inicia por la formacin

de radicales libres en el medio, lo que se logra

mediante la adicin al medio de los iniciadores
del proceso: Persulfato de Amonio /TEMED o
tambin la Riboflavina/Luz uv.

Tipos de Soporte en Electroforesis:

Poliacrilamida
La polimerizacin de la acrilamida sola no
origina un gel, sino una especie de goma que es
una disolucin muy viscosa de largas cadenas
lineales de acrilamida.
Para que se forme un gel propiamente dicho es
necesario que se creen uniones covalentes
entre esas cadenas; para ello se aade al
medio una molcula capaz de formar puentes
cruzados. La ms utilizada es la N,N' metilnbis-acrilamida (BIS), por su capacidad de
integrarse simultneamente en dos cadenas en
crecimiento.

Tipos de Soporte en Electroforesis:

Poliacrilamida

Tipos de Soporte en Electroforesis:

Poliacrilamida

Electroforesis
El objetivo ltimo de cualquier anlisis
electrofortico es, o bien la separacin
reproducible de los diversos componentes de
una muestra compleja, o bien la
caracterizacin precisa de la movilidad
electrofortica de una molcula, a fin de
deducir por ejemplo su tamao.
En ambos casos, el parmetro que nos va a
determinar el xito o el fracaso de nuestra
electroforesis va a ser la RESOLUCIN que
hayamos obtenido.

Electroforesis
Mediante electroforesis en Acetato de Celulosa es
posible identificar de 4 a 5 componentes proteicos
distintos en suero: albmina, alfa1, alfa2, beta y
gamma globulinas, estas ltimas como una banda
ancha.
En almidn es posible separar un componente ms,
la prealbmina; es decir, la resolucin es algo
mejor, puesto que podemos identificar molculas
que en acetato de celulosa pasaran desapercibidas
al coincidir con otras.
En electroforesis en poliacrilamida es posible
detectar de 30 a 40 componentes distintos, lo que
evidentemente supone mucha ms informacin que
la obtenida mediante las tcnicas anteriores, de
baja resolucin.

Electroforesis
Por ltimo, mediante electroforesis
bidimensional se puede comprobar que,
en realidad, en el suero hay varios
centenares de polipptidos distintos: la
resolucin de esta tcnica es muy
superior a las anteriores, por lo que
permite detectar prcticamente todos
los polipptidos presentes en una
mezcla compleja como es el suero.

Tipos de Electroforesis:
Electroforesis No Denaturante
Una protena en su estructura nativa
tendr una determinada relacin q/r y
migrar en un campo elctrico a una
velocidad proporcional a esa relacin,
tambin si el soporte tiene un tamao de
poro adecuado debe tomarse en cuenta
el efecto tamiz del soporte. La forma de
la protena depende del plegamiento de
la cadena polipeptdica.

Tipos de Electroforesis:
Electroforesis No Denaturante
Este tipo de electroforesis al no
desnaturalizar la protena permite
realizar ensayos biolgicos posteriores a
la separacin. La separacin puede
realizarse a cualquier pH entre 3-11

Tipos de Electroforesis:
Electroforesis Denaturante SDSPAGE

En este caso las protenas son desnaturalizadas

por diversos agentes como el SDS (dodecilsulfato de Sodio).
El SDS se une a las protenas mediante
interacciones hidrofbicas y las desnaturaliza
El SDS en concentraciones adecuadas se une a
las protenas en una relacin peso/peso
constante (1,4 g de SDS / g de protena) y les
proporciona carga negativa.
Habr entonces un nmero definido de cargas
negativa por residuo de aa. Los complejos SDSProtena tendrn la misma densidad de carga.

Electroforesis SDS-PAGE
Generalmente para lograr la
desnaturalizacin completa se agregan
agentes reductores como el Ditiotreitol
(DTT) o el -Mercapto etanol (-ME)
que rompen puentes disulfuro
Tambin se emplea un tratamiento
trmico a ebullicin por un par de
minutos.
Asi los complejos SDS-protena adoptan
una conformacin extendida o de bastn

Electroforesis: SDS-PAGE
Debido a que los complejos SDSprotena tendrn la misma densidad de
carga y conformacin. Cuando se realiza
la electroforesis en poliacrilamida las
protenas se separaran exclusivamente
en base a su tamao molecular.

Electroforesis: SDS-PAGE

Electroforesis: SDS-PAGE

Electroforesis: Revelado de
Protenas
Las protenas coloreadas naturales como
la mioglobina, hemoglobina, ferritina,
citocromo C, pueden ser observadas
directamente en el Gel.
Sin embargo para la mayora de las
protenas se requiere de una coloracin:
Rojo Ponceau, Azul de Coomassie,
Amido Black, tincin de plata.

Separacin de protenas del Suero en

Acetato de Celulosa

Electroforesis:Resolucin

Efecto de la cantidad de muestra aplicada sobre la resolucin.

Muestra: 7 protenas patrn, teidas con azul de Coomasie.
Carril superior, 3 l de muestra. Carril inferior, 15 l.
El origen de la electroforesis se encuentra a la izquierda de la imagen.

Electroforesis:Resolucin

Efecto de las irregularidades en la aplicacin de la muestra.

Protenas reveladas con Tincin de plata. El origen del gel se encuentra a la
Izquierda de la imagen. Carril superior, patrones aplicados correctamente.
En el carril inferior se puede observar el efecto de una aplicacin defectuosa,
probablemente por irregularidades en la superficie del gel en el pocillo de
aplicacin o por precipitacin de la muestra.

Electroforesis: Revelado de
Protenas

Determinacin del Peso Molecular

de protenas
El peso Molecular de diversas protenas
puede determinarse al comparar las
movilidades electroforticas de varios
marcadores de peso molecular conocido.
Estos marcadores de Protena Standard
deben ser tratados de la misma manera
que la muestra

Determinacin del Peso Molecular

de protenas
Proteinas Standard (PM)

Lisosima
Inhibidor de Tripsina
Anhidrasa Carbonica
Ovoalbumina
Albmina Serica Bovina
Fosforilasa B

14,400
21,500
31,000
45,000
66,200
92,500

Determinacin del Peso Molecular

de protenas
Para cada tipo particular y
concentracin de gel, existe una relacin
aproximadamente lineal entre el Log PM
de los complejos SDS-Protena y su Rf.
El Rf corresponde a la relacin entre la
distancia migrada por la protena y la
migrada por el marcador del frente de
corrida.

Determinacin del Peso Molecular

de protenas

Determinacin del Peso Molecular

de protenas

ISOELECTROENFOQUE
Es una tcnica electrofortica donde
son fraccionados compuestos anfoteros
de acuerdo a su PI a lo largo de un
gradiente de pH. Las protenas migraran
hacia el nodo o ctodo de acuerdo a su
carga neta hasta alcanzar la regin de
su PI. En este punto con carga neta
cero, se concentraran.

ISOELECTROENFOQUE
Comercialmente se pueden conseguir anfolitos
con rangos de pH 2,5 -1, pero la separacin
usualmente se da entre pH 3,5-10 En ausencia del Campo elctrico los anfolitos
se distribuirn al azar, pero al conectar el
sistema estos migraran de acuerdo a su carga
neta hasta alcanzar su PI.
Estos anfolitos tienen una alta capacidad
buffer.

ISOELECTROENFOQUE
Posteriormente se carga la protena
problema sobre el gel y se conecta el
sistema. Las protenas migrarn hasta
alcanzar su PI.
El IEF es una tcnica de equilibrio.
Permite determinar un parmetro
fisico-qumico intrnseco de la protena
(PI)

Electroforesis Bidimensional
Resulta de la combinacin de dos
tcnicas electroforticas en una
dimensin.
La combinacin ms usada es la IEF en la
primera dimensin y a continuacin un
SDS-PAGE en segunda dimensin,
resultando as en una separacin
mediante la carga (PI) y el tamao.

Electroforesis en Agarosa para

DNA
Se utilizan concentraciones de Agarosa
entre 0,4-4%
El buffer ms utilizado es Tris-AcetatoEDTA (TAE) y el Tris-Borato-EDTA
(TBE)
La muestra es colocada junto con
glicerol y marcadores de frente de
corrida como el Xyleno xianol y Azul de
Bromofenol

Electroforesis en Agarosa para

DNA

Electroforesis en Agarosa para

DNA
El Revelado del DNA se realiza
incubando el gel en una solucin de
Bromuro de Etidium (agente
cancerigeno, teratogeno y mutgeno)
El BrEt es un compuesto fluorescente
que se intercala al ADN o ARN, y
fluorece de un color naranja bajo la luz
ultravioleta

Electroforesis en Agarosa para

DNA