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Dfinition du clonage

Dfinition du Gnie gntique


Dfinition du plasmide
Caractristiques des plasmides du clonage
Enzymes de restriction
ADN ligase
Clonage dun gne dans un plasmide
Usage des plasmides recombinants
Rfrences bibliographiques

Le clonage
Terme issu du grec kln : rejeton. Le terme
clonage est l'opration qui partir de cellules
isoles, permet d'obtenir une ligne
(plusieurs cellules similaires appeles clones)
drivant d'un seul anctre.
Lorsque les scientifiques parlent de clonage
gntique, ils ne pensent pas la
reproduction d'un organisme mais plutt
celle d'un gne spcifique. Le clonage
gntique est un lment du gnie gntique

Le gnie gntique
Le gnie gntique (ou ingnierie gntique)
est un ensemble de techniques, faisant partie
de la biologie molculaire et ayant pour objet
lutilisation des connaissances acquises en
gntique
Il permet :

d'identifier
d'isoler
de transfrer
de modifier de manire contrler le matriel
gntique

Le plasmide
Un plasmide dsigne en
microbiologie ou en bi l i o og e mol
l i cu a re une mol l cu e d'ADN
distincte distincte de l'ADN
chromosomique chromosomique,
capable capable de rplication
rplication autonome autonome. Le
terme plasmide plasmide fut
introduit par le biologiste molculaire
amricain Joshua Lederberg en 1952.

Une cellule bactrienne peut en


contenir :
pour les grands plasmides => une
copie
pour les plasmides plasmides
artificiels (construits par gnie
gntique des fins de clonage de
gnes) =>des centaines

Pourquoi les plasmides


comme vecteurs de clonage ?
Ont une petite taille contrle de
rplication relch se m ltiplient
multiplient dans les cell les cellules j
sq ' jusqu' ce q eu chaq eu cellule
ait en moyenne 10 200 copies du
plasmide. portent au moins un gne
codant pour un marqueur de
slection contiennent contiennent
plusieurs plusieurs sites de
restriction

Le principe du clonage:
Le principe du clonage est simple. Il consiste i
ns rer un segmen t d'ADN tranger dans une
petite molcule capable de se rpliquer de faon
autonome. Ce type de mol l cu e d'ADN est
appel un vecteur de clonage. Un vecteur de
clonage courant est le plasmide bactrien. L'ADN
du plasmide est coup par une enzyme de
restriction et li in vitro au fragment d'ADN tran
ger cou p par la mme enz yme de restriction ou
une enzyme qui donne des extrmits extrmits
compatibles compatibles. Lorsqu un ' transformant
stable a t obtenu, la squence est dite clone.

Parmi les caractristiques connus


pour tre de bons vecteurs de
clonage c'est que: ils doivent porter
des marqueurs gntiques parti li cu
ers, comme des gnes de rit s s
ance aux antibiotiques antibiotiques
ou le gne codant la
galactosidase.

ils doivent doivent porter un ou plusieurs


plusieurs sites de restriction uniques dans une
rgion qui n'est pas essentielle pour la rplication
des plasmides. et si possible possible, ils
doivent doivent avoir des sites de restriction
uniques dans des gnes codant des marqueurs
slectifs. Ces marqueurs sont inactivs inactivs
lorsqu on ' y insre un fragment fragment dADN '
tranger. Le choix de ce site est dict par les
connaissances antrieures concernant la cartog p
ra hie du gnome bactrien .

Les enzymes enzymes de


restriction:
Les enzymes de restriction sont des
enzymes qui reconnaissent des squences
de 4 8 paires de base appeles sites de
restriction restriction , et y scindent
scindent les deux brins d'ADN, comme ils
incisent dans le corps de la mol l cu e, on
les appelle end l onuc ases de restriction
. Ils sont produites par les b i act r es pour
se protger de lADN tranger provenant
dautres organismes (ex phages).

Les sites de restriction restriction


sont de courtes courtes squences
squences reptes reptes , c est '
dire identiques identiques sur
chaque brin lu de 5' en 3'. Etant
donn que l'ADN de chaque
organisme possde une squence
propre, les enzymes de Restriction ,
le trononnent en un jeu unique et
reproductible de fragments de

L'ADN propre de la bactrie est


protge contre l'incision par un
autre enzyme l'enzyme
modificateur , qui le modifie modifie
en sites prsomptifs prsomptifs de
cli age clivage ou en son voisinage
oisinage, par mthylation d'une ou
de deux bases gnralement
infrieur aux sites de restriction . Ce
site une fois mthyl, l'endonuclase

Beaucoup d'enzymes de restriction produisent des


fragments d'ADN bouts collants le mcanisme est le
suivant : Certains enzymes coupent lADN au niveau de la
mme base sur les deux brins, on obtient alors de
fragments bout franc c'est dire dont les nuclotides
terminaux sont apparis leur symtrie comme par
exemple exemple ECoR V ou NrUI . Plus souvent, souvent,
ces enzymes enzymes coupent les deux brins de faon
dcale, on obtient alors des fragments fragments avec
une extrmit extrmit cohsive cohsive. Si on ajoute
un autre fragment avec les mmes extrmits cohsives,
les bases vont sapparier. On peut refaire des liaisons
covalentes en utilisant une ADN ligase.

D'autres coupent l'ADN au niveau des bases en


produisant des fragments bouts collants comme
par exemple exemple Pst I . Les bouts forms par
un enzyme de restriction en un site donn sont
complmentaires complmentaires de ceux de
tous les fragments obtenus avec le mme enzyme
de restriction . A temprature temprature
ambiante ambiante, ces rgions monocatnaires,
qualifies de bouts coll t an s s' it apparient
moment t an ment celles des autres fragments
d'ADN produits par le mme enzyme de restriction
quelle que soit la source d'ADN.

A pr s restri i ct on, le mlange des


fragments dADN est soumis une l
t h lectrophorse sur gel, qui
spare les diffrents diffrents
fragments fragments en fonction
fonction de leur taille. Aprs ajout d
un colorant colorant qui s intercale
intercale dans la double hlice de l
ADN , on peut visualiser visualiser
les diffrents fragments sous UV

On connat environ 40 enzymes de


restriction qui reconnaissent chacune
une squence diffrente, appele
site de restriction restriction.Voici
parmi eux les plus utiliss utiliss:
Alu I ,Taq I , Hpb I ,Hga I ,EcoR I ,Hind
III , Not I , sfi I . La technique
technique suivante suivante montre
le dcoupage dcoupage d un '
plasmide plasmide par un enzyme de

Usage du clonage via plasmide


bactrien

Est un vaccin partir de levure


gntiquement modifie, et se transfre
souvent de personne personne par le sang
contamin et elle pose un problme pour les
utilisateurs des mdicaments, les patients
dialyses et les individus ncessitent des
transfusions rptes. Le virus de lhpatite
B ne peut se dvelopper et tre produit que
dans le sang de primates infects
artificiellement(Jerome 2004).

Usage du clonage via plasmide


bactrien
On utilise cette technique en
gntique thrapeutique, pour
mettre au point des vaccins, des
drogues et des tests gntiques.
(voir chapitres sur organismes
transgniques et thrapie gnique et
tests gntiques)

Production des vaccins


protine vaccinante contre la rage et
lhpatite B.

Le sang dindividus chroniquement


contamins par ce virus prsente
une particule protique appele
antigne HBs .cette particule nest
pas toxique en elle-mme mais elle
constitue un inducteur efficace pour
la production danticorps antihpatite B. Cette protine a t
clone chez Saccharomyces
cerevisiae (Jerome 2004) .

Lhormone de croissance
humaine
Utilise pour traiter les dficiences
pituitaires entrainant le nanisme,
tait prcdemment obtenus en
prlevant les glandes pituitaires
dhumain dcds. Obtenir
suffisamment dhormones tant la
fois difficile et couteux, lutilisation
de cette hormone tait de ce fait
trs limite. Lhormone de croissance
extraite danimaux nest pas

Le gne pour la synthse de


Lhormone de croissance humaine a
t galement introduit chez
Escherichia coli qui constitue la
source commerciale de lhormone.
Prs de 30000 enfants prenaient
cette hormone aux Etats-Unis en
1998 (Jerome 2004).

Jusqu' une priode rcente


linsuline utilise dans le traitement
des diabtes humain tait extraite du
pancras danimaux sacrifis.
Linsuline issus du porc et des bovins
prsente 2 inconvnients:

Ce nest prcisment la mme que


linsuline humaine dun point de vue
structural et elle nest de ce fait pas
aussi efficace
Les prparations dinsuline
contiennent des protines animales
susceptibles de provoquer des
ractions allergiques chez certains
diabtiques (Jerome 2004).

Depuis 1984, la production


industrielle dinsuline humaine est
ralise par des Escherichia coli
gntiquement modifies (Jerome
2004).