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Clonage
Mahmoudi Lobna
L3
A. Dfinitions
Un vecteur est une squence d'ADN
permettant la propagation, la slection,
la modification d'une squence d'ADN
d'intrt.
En
bref
l'tude
et
la
manipulation d'une squence d'ADN
isole.
Le clonage est l'action d'isoler et
d'insrer dans un vecteur un fragment
d'ADN d'intrt pour le multiplier
l'identique.
L'ADN gnomique est le support
physique de l'ensemble des gnes de la
B. Utilit
Permet de conserver
squence d'ADN
donne.
une
C. Principes
Un Vecteur
Circulaire
Linaire
Une Cellule hte
Procaryote
Eucaryote
Un fragment d'ADN
gnomique
ADN
rplication
de
type
procaryotique
et/ou
- Prparation du vecteur
- Incorporation lhte
1. Obtention de lADN
recombinant
+ traitement
PAL
2. La ligation
(ligature...)
Une enzyme,
la ligase, est
capable
de
lier de faon
covalente
deux
molcules
dADN
en
une.
du
fragment dADN qui peut tre clon
dans VECTEURS
chaque vecteur HOTE
INSERT
(Kb)
Plasmides
Bactrie
10
Phage lambda
Bactrie
25
Cosmide
Bactrie
45
Phage P1
Bactrie
100
(bacterial artificial
chromosome)
Bactrie
300
Levure
1000
BAC
YAC
comme
un
de
rplication
un
ou
plusieurs
Carte du plasmide
pBR322
pUC8
polylinkers de pUC8 et
ACGAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTGGCACTG
pUC9
Polylin
ker
pUC 9
ACGCCAAGCTTGGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCACTG
Polylin
ker
6. Introduction de lADN
recombinant dans les cellules
type procaryotique
htes
De
(bactries):
Cas
dun
vecteur
plasmidique: lADN est
introduit
dans
les
bactries
traites
spcialement
le
plus
souvent
par
choc
thermique ou par choc
lectrique.
lectroporateur
AmpR
TetR
AmpR
TetS
Clone intressant
(-
LES PHAGES
Virus
de
bactrie-infectieux
:
Rendem
: 48 Kb
=
de
De type
procaryotiqu
e:
Cas dun
vecteur
phagique
YAC
:
Artificial
Yeast
chromosome
CM
:
gne
de
rsistance
au
squence dADN
Cration
des
banques
gnomiques et dADNc
dADN
Banques dADN
-Banques
gnomique
dADN
- Banques de cDNA
Comment
dfinir
si
une
banque
est
suffisamment grande pour esprer trouver un
fragment
dintrt?
Calcul afin
de dfinir la probabilit de trouver une
squence donne dans une banque.
N=In(1-P)/In(1-f)
N: nombre de recombinants
P: probabilit dsire
f:
proportion
de
gnome
dans
un
seul
recombinant
Ex: 99% de probabilit davoir une
squence reprsente dans une banque
de fragments de 17kb dun gnome
eucaryote (3.109pb)
N=
In(1-0.99)/In(1(1,7.104/3.109))=8,1.105 colonies
Banque dADNc
Le
problme
ici est
lobtention
de clone dit
full
length.
A
partir
lARN:
Principe
"reverse
de
transcription":
de
la
Production de protines
Utilisation de vecteur
dexpression
Production de protines
humaines but thrapeutique
- Facteur VIII de la coagulation
dans lhmophilie A
- Hormone de croissance
- Insuline
Exemple de
linsuline
CELLULES HTES
-Bactries : E. Coli
premier hte utilis
nombreux vecteurs plasmidiques connus
et utilisables
culture en masse dans les fermenteurs
taux dexpression levs (plusieurs g de
protine/litre)
MAIS secrtent mal les protines : clatement
des bactries
-pas
de
modifications
posttraductionnelles