Agrotecnologa

Produccin de Proteasas
Diego Armas; Fabin Guerrn
Enero, 2015

Seleccin y optimizacin de la produccin de

proteasas a partir de Bacillus licheniformis
1. Introduccin

Las enzimas son biomolculas que actan como catalizadores en los procesos
metablicos de las clulas.

Son muy utilizadas en la industria alimenticia, farmacutica, qumica.

Se han identificado mas de 3000 enzimas diferentes

 Extremfilos

Halfilos

Proteasas microbianas
Estas representan el 60% de ventas totales de enzimas en el mundo.
Una de las enzimas ms utilizadas es la proteasa alcalina producida por Bacillus.
La produccin de enzimas a nivel industrial busca aislar y caracterizar enzimas.
Como por ejemplo se ha aislado Bacillus licheniformis halotolerante TD4 y se ha
influido en la produccin de proteasas tomando en cuentas diversos aspectos
qumicos y fsicos.

Materiales y Mtodos
Casena enzimtica hidrolizada
Carbono
Fuentes de nitrgeno (99% puro).

Las muestras de la cepa bacteriana fue recogida de un estanque en la india, esta

muestra fue diluida en una solucin salina estril en cajas Petri con NaCl al 5% e
incubada a 37C.
Produccin proteoltica de las cepas bacterianas se proyect en placas de agar
suplementado con 5% de NaCl y 1% de casena (MNA). Las placas se incubaron
durante la noche a 37 C.
Seguidamente se identific usando varias pruebas bioqumicas y secuenciacin
gentica ARNr 16s. El ADN fue amplificado mediante PCR y se secuencio por
macrogen.

Materiales y Mtodos
El cultivo de la cepa productora de proteasa (1%) se inoculo en el medio de
cultivo con 5% de NaCl, 1% de casena, pH 7,0 y se mantuvo en incubacin por
24 horas con agitacin (150 rpm).
Luego se centrifugo la muestra a 10000 rpm durante 15 min a 4C.
El sobrenadante libre de clulas fue utilizado para el ensayo de proteasa por el
mtodo de Anson.
La mezcla contiene 1 ml de enzimas para 1 ml de casena (1% w /v en 50 mM de
tampn de fosfato de potasio, pH 7,5) y la mezcla se incub durante 10 min a 37
C.
La reaccin se termin mediante la adicin de 2 ml de cido tricloroactico al 10%
y se mantuvo durante 30 min de incubacin a temperatura ambiente y luego se
centrifug por 15 min a 10.000 rpm.
Despus, 2 ml de filtrado se mezcl con 3 ml de solucin de carbonato de sodio
500 mM y la absorbancia se midi a 280 nm.

Materiales y Mtodos
Los parmetros como pH, agitacin, inculo y perodo de incubacin fueron
analizados tomando muestras del cultivo bacteriano que crece con 1% de casena y
pH 7. Se prepar medios de cultivo con escalas de pH de entre 2 y 10, con
agitaciones 50-300rpm con 50rpm como variacin unitaria. La incubacin fue a
37C observando cambios cada 6 horas.

Materiales y Mtodos
Para optimizar las fuentes de NaCl, C y N se estudi la variacin de las
concentraciones de sal de 0 a 2M con una variacin de 0,5 M en MNB. MNB se
complement con diversas fuentes de carbono tales como xilosa, dextrosa,
fructosa, sacarosa, galactosa, manosa y lactosa (1% w / v) y fuentes de
nitrgeno como nitrato de potasio, urea, nitrato de sodio, cloruro de amonio,
nitrato de amonio y carbonato de amonio (1% w / v).
Despus de 24 h de incubacin, el sobrenadante libre de clulas se cuantific
para la produccin de proteasa.

Resultados y Discusin
Aislamiento y deteccin de proteasas producido por bacterias.
De 15 bacterias halotolerantes de Laguna de Salinas analizadas,
slo 6 cepas fueron identificadas como productoras de proteasa.
La cepa TD4 con mayor produccin (89.87 U/mg) en comparacin
con otras cepas.

Resultados y Discusin
Caractersticas de la cepa potencial TD4.
Rasgo caracterstico
Morfologa de la colonia
Tincin Gram
Tincin Esporas
Movilidad
Indol
Rojo de metilo
Prueba de Voges-Proskauer
Citrato
Catalasa
Oxidasa
Prueba de nitrato
Produccion de H2S
Almidn
Glucosa
Sacarosa
Lactosa

Cepa TD4
Grande , redonda, irregular, mucoide
Gram positiva, forma de barra
Forma esporas
Es mvil
Positiva
Negativa
Positiva
Positiva
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Positiva
Positiva
Negativa

o Mostr una tolerancia de

hasta 2M de NaCl.
o 3.0 5.2 m en longitud y
0.4-0.7 m en anchura.
o Pariente ms cercano de
la familia Bacillaceae,
mostrando una similitud
de secuencia de 97% con
su ms cercano pariente
Bacillus licheniformis.

Resultados y Discusin
Optimizacin de las condiciones de cultivo para la produccin
de proteasa.
Efecto del NaCl
oMayor concentracin de sal
crea cambios en la composicin
lipdica de la membrana celular,
originando que la tasa de
crecimiento disminuya junto con
la produccin de enzimas.
o1 M lo ptimo.

Resultados y Discusin
Optimizacin de las condiciones de cultivo para la produccin
de proteasa.
Efecto del Carbono
oSe destac el medio que
contiene xilosa (94.77 U/mg)
seguido de fructosa (94.26
U/mg), y los de menor
produccin de la enzima se
registr al medio con almidn
(87.13 U/mg).

Resultados y Discusin
Optimizacin de las condiciones de cultivo para la produccin
de proteasa.
Efecto del Nitrogno
oSe destac la urea (108.13
U/mg) y el bicarbonato de
amonio (94.34 U/mg).
oOtras
fuentes
tambin
utilizadas fueron derivadas de la
soya, cidos casaminos y
peptona.

Resultados y Discusin
Optimizacin de las condiciones de cultivo para la produccin
de proteasa.
Efecto del pH
oB. licheniformis TD4 podra
crecer y producir proteasa en un
amplio rango de pH que va de
2.0 a 10.0, donde su produccin
mxima se alcanz a pH 8
(135,50 U/mg).

Resultados y Discusin
Optimizacin de las condiciones de cultivo para la produccin
de proteasa.
Efecto de la agitacin
oLas velocidades de agitacin
para la produccin de proteasa
fueron de 250 rpm (90,15 U/mg).
oTubo un rango comprable de
150 a 250 rpm, con otros
Bacillus sp.

Resultados y Discusin
Optimizacin de las condiciones de cultivo para la produccin
de proteasa.
Efecto de la conc. inculo
oLa produccin mxima de proteasa
se observ en el 1% de inculo
(104.14 U/mg)
oHubo una reduccin en la
produccin de proteasa cuando
tamao inculo fue reducido a 0,2%
(nmero insuficiente de las bacterias).
oMayor tamao de inculo puedo dar
lugar una reduccin de oxgeno
disuelto y el aumento de la
competencia hacia los nutrientes.

Resultados y Discusin
Optimizacin de las condiciones de cultivo para la produccin
de proteasa.
Efecto del t de incubacin
oLa cepa TD4 tiene capacidad
para producir proteasa mximo
en el plazo de 24 a 30 horas,
siendo el ptimo 24 horas
(101.30 U/mg).
oOtras bacterias tienen mayor
tiempo de incubacin para
produccin de proteasas.

Conclusin
Los parmetros establecidos para la optimizacin de produccin
de proteasa del Bacillus licheniformis son los siguientes.

PRODUCCIN
DE
PROTEASAS

141,46 U/mg

Referencias

Suganthi, A. Mageswari, S. Karthikeyan, M. Anbalagan, A. Sivakumar, K.M. Gothandam.

(2013). Screening and optimization of protease production from a halotolerant Bacillus
licheniformis isolated from saltern sediments. Tamil Nadu, India: School of Bio Sciences
and Technology.
Glazer, A., Nikaito, H. (2007). Microbial Biotechnology: Fundamentals of Applied
Microbiology.