CRECIMIENTO MICROBIANO

El crecimiento se define como un

incremento en el nmero de clulas

En procariotas contina hasta que se
divide en dos nuevas clulas en un
proceso llamado fisin binaria
Cada clula hija recibe un cromosoma
completo y copias suficientes de
macromolculas, monmeros e iones
inorgnicos para vivir en forma
independiente
Bajo condiciones nutricionales
estables la bacteria E. coli puede
completar su ciclo en 20 minutos
El tiempo es variable y depende de
factores nutricionales y genticos

CRECIMIENTO POBLACIONAL
La velocidad de crecimiento es el

cambio en el numero de clulas por

unidad de tiempo
El tiempo de generacin es el
requerido para duplicar una poblacin
de clulas
Este modelo en el que el nmero se
duplica por unidad de tiempo se
denomina crecimiento exponencial
Una caracterstica es que al
comienzo es bajo y luego incrementa
en una explosin del numero de
clulas
Se utiliza para ensayar el efecto
positivo o negativo de algn
tratamiento sobre el cultivo
bacteriano

TIEMPO DE GENERACION
En un cultivo creciendo exponencialmente hay una relacin

directa entre el numero de clulas presentes en el momento

inicial (N 0) y en un momento determinado del crecimiento

N = N0 * 2

donde N= nmero final de clulas y n= nmero de generaciones

El tiempo de generacin g de la poblacin celular se calcula

como:

g = t/n

donde t= horas o minutos

Los tiempos de generacin son usados para ensayar efectos

positivos o efectos negativos

CICLO PROCARIOTICO
Antiguamente se pensaba que los ciclos bacterianos carecan de

eventos calve dado que no hay mitosis y la sntesis de ADN pareca

continua durante todo el ciclo
En la actualidad se conocen fenmenos clave : fase C o de
sntesis del ADN (equivalente a la S eucaritica); replicacin del
ADN; fase D que termina con el final de la divisin celular (equivale a
la M eucaritica) ; fase de intervalo (similar a la G1 eucaritica)
Las fases C y D son relativamente constantes y cuando disminuye el
tiempo de generacin (g) lo hace a expensas de la fase G1 . En el caso
de E. coli la fase C= 40 minutos y la fase D= 20 minutos
Cuanto ms rico es un medio , el tiempo de generacin es menor y
mayor es el tamao medio de las clulas
Si se inocula una clula cultivada en un medio pobre (g=60 min,
C+D= g) a un medio ms rico (g=35 min) se observa: la primera
divisin ocurre a los 60min idntico al medio anterior , pero el inicio de
una nueva ronda de replicacin ocurre antes (C+D se superponen) y
se obtiene un tamao mayor que en el medio pobre y una masa de
inicio mayor

CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS

Una poblacin bacteriana presenta un patrn de

crecimiento cuando se inocula en un medio de cultivo

fresco cerrado (lquido o slido)
En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento
dura slo unas cuantas generaciones debido al
agotamiento de nutrientes y/o acumulacin de desechos
En estos sistemas hay una fase de latencia (fase
lag) de retraso mientras las clulas se ajustan a las
nuevas condiciones es un perodo de ajuste metablico
que depende del tamao del inculo, bondad del inculo
(estado metablico previo)
Fase exponencial o fase logartmica de
crecimiento continuo donde se da un crecimiento
balanceado no restringido durante unas pocas
generaciones (menos de 10), el valor de (g) depender
de la composicin del medio, temperatura, pH,

CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS

Fase estacionaria se caracteriza porque el coeficiente de crecimiento

se hace nulo pero aun existe crecimiento que se equilibra con las muertes
celulares, se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de
desecho, incluso el pH se hace inadecuado, aun hay reacciones
metablicas pero el metabolismo es diferente (clulas son ms chicas) al
de la fase logartmica , el citoplasma se condensa, la membrana se hace
menos fluida y suele ser ms resistente a los agentes fsicos y qumicos
Fase de muerte si la incubacin continua en la fase estacionaria, las
clulas empiezan a morir y hay incluso lisis celular , es tambin una
funcin exponencial pero ms lenta que la exponencial

CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS

Un medio slido es una solucin nutritiva (como el lquido), pero
SLIDOS

incorporado a un gel, que le da consistencia.

Los tipos de gelificantes ms usados para los medios slidos: agaragar (o simplemente, agar) es el ms usado; gelatina (tiene el
inconveniente que se licua a temperaturas relativamente bajas)
Los medios slidos se suelen inocular mediante asa de siembra o
esptula, diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en placas
de Petri .Tras la incubacin a la temperatura y condiciones adecuadas,
cada bacteria o agrupacin bacteriana da origen, por crecimiento, a una
acumulacin de clulas, visible a simple vista, denominada colonia
La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 107 clulas
para una colonia de unos 5 mm). Se debe a que las bacterias no pueden
dispersarse, y durante mucho tiempo este medio slido permite un
aporte continuo de nutrientes y eliminacin continua de productos de
desecho. Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no
hay drenaje de clulas.
Con vistas a la determinacin taxonmica, se suele tomar nota de
una serie de caractersticas de las colonias: tamao, forma general y de
bordes, color, consistencia, aspecto de la superficie y elevacin sobre el
sustrato

MEDICION DEL CRECIMIENTO

CAMARA DE
PETROFF HAUSSER
Se puede medir siguiendo los cambios en el

nmero de clulas o el peso de la biomasa celular

El nmero de clulas se puede medir al
microscopio y se llama recuento directo
Se puede realizar en muestras secas o lquidas para
las que se usan cmaras especiales de recuento
donde el valor de clulas es convertido a clulas por
mililitro de suspensin
Cmara de Petroff Hausser: portaobjeto
especial con graduacin en superficie y medidas
concretas:
0.02 mm de profundidad
rea de 1 mm 2 dividida en un retculo de 25
cuadrados grandes
cada cuadrado grande est subdividido a su vez
en
4 x 4= 16 cuadrados pequeos
la muestra se distribuye en 16 x 25= 400 celdillas

MEDICION DEL CRECIMIENTO

La muestra dispensada entre porta y cubre se

deja reposar unos minutos y se cuenta el nmero de

clulas en varias celdillas (en general 16
equivalente a un cuadrado grande), se anota el
nmero n y se establece:
n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas /
ml
Limitaciones:
las clulas vivas no se distinguen de las muertas
las clulas pequeas son difciles de apreciar
se requiere habilidad para obtener precisin
se necesita contraste de fases cuando la muestra

no est teida
no es bueno para suspensiones poco densas, slo
sirve para suspensiones concentradas ( mayores a
10 x 10 6 cel./ml)

RECUENTO
DE
VIABLES

El recuento en placa determina el nmero de clulas capaz de generar

colonias sobre la superficie de un medio slido

Hay dos formas, por siembra en superficie: se siembra 0.1 ml de
muestra y se extiende por la superficie con una barra de vidrio o metal
O bien, por siembra en profundidad: se siembra de 0.1 a 1.0 ml en la
placa de Petri y se agrega el medio slido fundido (40 C) y se incuba
Por este mtodo se pueden usar volmenes ms grandes
Hay que tener en cuenta que el organismo a ser contado resista
temperaturas de 40 a 45 C
El nmero de colonias que puede ser contado oscila entre 30-300
colonias

DILUCIONES
Cuando el cultivo es denso se

usa el mtodo de diluciones

Se usan diluciones seriadas
en base 10: 1.0ml de muestra en
9.0ml de diluyente o bien, 0.5ml
muestra en 4.5ml de diluyente
El nmero de colonias depende
del inculo , medio de cultivo y
las condiciones de incubacin
(medio de cultivo, temperatura y
tiempo de incubacin)
La expresin del resultado
ser como unidades
formadoras de colonias por
mililitro (ufc/ml) ya que la ufc
puede contener ms de una
clula

MASA CELULAR Y
TURBIDEZ
Medida de la masa bacteriana: Mtodos directos
Se puede determinar el peso seco donde la masa seca (estufa a 105

C toda la noche) es aproximadamente entre el 10 al 20% de la masa

hmeda
Inconvenientes: mtodo tedioso que requiere tiempo y errores en
pesadas ( 1 mg de peso seco equivale a una masa bacteriana de 5 x 10 9
bacterias)
o bien, el peso hmedo donde se centrifuga y se elimina el
sobrenadante y se determina el peso del sedimento
Inconvenientes: grandes errores debido al lquido intercelular retenido,
tipo y forma de las agrupaciones de la cepa, etc
Determinacin de componentes caractersticos: peptidoglicano,
ARN, ADN, protenas se usan en bacterias que forman grumos no
dispersables o crecen en filamentos en general se emplean en
determinaciones en ambientes naturales
Mtodos indirectos :
Turbidimtricos (pticos): la base comn consiste en la medicin de
la cantidad de luz dispersada o trasmitida a travs del cultivo
bacteriana. La dispersin de la luz dentro de ciertos limites es
proporcional a la masa del cultivo

MASA CELULAR Y
TURBIDEZ
Escala de Mc Farland: es

una serie de patrones de turbidez

(precipitado de SO4 Ba)
previamente calibrados y se
establece la equivalencia entre la
turbidez de cada tubo y la masa
o concentracin de bacterias
(clulas/ml) que genera una
turbidez similar
Un mtodo ms til es la
medida de turbidez con
fotmetro o espectrofotmetro
que hacen pasar luz a travs de
las suspensin celular y detectan
la cantidad de luz no dispersada
Los resultados se expresan
en unidades fotomtricas o
unidades de densidad ptica
proporcionales al nmero de
clulas y a la masa celular

MASA CELULAR Y
TURBIDEZ
Hay que realizar una curva

estndar de calibracin que

relacione medidas directas
(recuento en placa o microscopa)
con las indirectas de turbidez
En el mtodo de turbidimetra
es necesario determinar el
contenido de ufc/ml de la muestra
original (de la cual se hicieron las
diluciones para la calibracin) con
el mtodo de recuento en placa.
Con esta informacin y las
absorbancias de las diluciones, se
hace una curva de calibracin.
Teniendo esta curva, se podr
determinar las ufc/ml de otras
muestras luego de leer la
absorbancia de las mismas.

 Contadores electrnicos de

partculas : se pasa una suspensin

bacteriana por un tubo capilar entre
los dos polos de una corriente
elctrica
Cada vez que pasa una bacteria se
interrumpe la corriente y es recogida
por un dispositivo electrnico que
detecta el numero y tamao de las
partculas que van pasando (el tamao
es funcin de la intensidad del pulso
de voltaje al paso de la partcula)
Citometra de flujo activada por

fluorescencia (FACS): las partculas

se marcan antes con anticuerpos
monoclonales hacia alguna molcula
de superficie y se unen a un
fluorocromo (molcula que se excita al
absorber la radiacin lser y emite
fluorescencia a diferente longitud de
onda)

EL QUIMIOSTATO
Es un reactor que mantiene el

crecimiento bacteriano en la fase

exponencial
Es un cultivo continuo el volumen
se mantiene constante (recambio entre
medio fresco y usado) y se alcanza un
estado de equilibrio entre el nmero
de clulas y su estado metablico
Es un cultivo balanceado mantenido
por tiempo indefinido por un sistema
de flujo que se compone: una cmara
de cultivo de volumen constante a la
que llegan nutrientes y de la que se
eliminan los productos txicos de
desecho
Caractersticas: estado constante o
estable; concentracin bacteriana y
concentracin del sustrato: constante;
tasa de dilucin y rendimiento celular:
constante

Se usan dos elementos de control: la velocidad de dilucin y la

concentracin del nutriente limitante (C o N)

La velocidad de dilucin controla la velocidad de crecimiento en
rangos muy amplios y la densidad celular (clulas/ml) esta controlada
por el nivel del nutriente limitante
Los parmetros a tener en cuenta son: f (ml/h); volumen cmara de
cultivo (ml); densidad celular (x); factor de dilucin D=f/v (h -1)
Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m) se haga igual al
factor de dilucin (D), entonces dx/dt=0 y por tanto la cc de las clulas
se hace constante (x=x) y el cultivo se encuentra en estado
dinmico de equilibrio

EL
QUIMIOSTATO

 Los MO pueden cultivarse en una amplia gama de tasas de crecimiento

exponencial y permite crecimientos balanceados y restringidos ya que el

nutriente o sustrato est presente en una concentracin baja como para
limitar la densidad de poblacin
Sin embargo, a tasas altas de dilucin la concentracin microbiana cambia
rpidamente y el cultivo puede ser lavado totalmente (dilucin crtica)
A muy bajas diluciones el quimiostato no funciona si el nutriente limitante
es la fuente de energa ya que slo se usa para reacciones de mantenimiento
celular y no para crecimiento (energa de mantenimiento) como ser potencial
de membrana, trasporte activo o sntesis de protenas

EL
QUIMIOSTAT
O

 Aplicaciones:
Procesos industriales de fermentacin (produccin de bebidas alcohlicas, de

antibiticos, de aminocidos, etc)

Permite estudiar: aspectos fisiolgicos (catabolismo de sustrato limitante), seleccin
de mutantes ; estudios ecolgicos
Su aplicacin ms conocida es para la depuracin de aguas ya sea
mediante procesos aerbicos o anaerbicos . El medio de cultivo fresco es el agua
residual que entra en la planta y alimenta a los fangos activados por MO que luego se
retiran por decantacin

EL QUIMIOSTATO

FACTORES AMBIENTALES
El abanico es amplio y va desde puntos por debajo de la

congelacin del agua hasta 110 C, el rango habitual es 30 C

Se distinguen cuatro grupos:
Psicrfilos con temperaturas bajas 0-20 C,
Mesfilas con medianas 20-45 C,
Termfilas ms altas 60- 90 C
Hipertermfilas con muy altas 90-110 C
Congelacin: existe un lmite por el cual es imposible la
reproduccin, hay crioprotectores (glicerol y dimetilsulfxido) que
permiten su conservacin a temperaturas (-70 C)
Termofilia: termfilos poseen membranas ricas en cidos grasos
saturados que les dan estabilidad a altas temperaturas. Las
eucariotas estn ausentes por encima de
60 C debido a la porosidad de sus membranas
La temperatura favorece reacciones del metabolismo bacteriano:
-Acelera su capacidad de sntesis
-Velocidad de multiplicacin ms rpida
Regla de Vant Hoff: "la velocidad de las reacciones qumicas se
duplica por cada incremento de 10 C de la temperatura

FACTORES
AMBIENTALES

Cloruro de
Sodio

Cloruro de sodio: el agua de mar tiene una concentracin del 3%

, los organismos que se aslan del mar tienen requerimientos

especficos para el sodio y se llaman halfilos pudiendo ser:
Moderadamente halfilo (6-15%),
Discretamente halfilo (1-6%),
Halfilos extremos (15-30%)

pH

y ACTIVIDAD DEL AGUA

Acidez y alcalinidad - pH: slo unas pocas especies pueden crecer a

pH extremos, la mayora de los ambientes naturales tiene 5.9. Segn su

tolerancia al pH:
Los que crecen a pH cidos (1-5.5) son acidfilos
Los que crecen a pH bsicos (8.5-11.5) alcalfilos
Los que crecen a pH neutro (5.5-7.0) neutrfilos
La mayora de las bacterias tienen su pH ptimo (exterior) entre 5-9 y
cambian el pH de su hbitat acidificando o alcalinizando y con ello
facilitan o impiden la supervivencia de otras especies bacterianas.
Acidgenas: acidifican su entorno al liberar productos cidos
Acidricas: crecen en un medio cido y son capaces de hacerlo ms
cido
Actividad el agua: la disponibilidad el agua se expresa en trminos
fsicos como actividad del agua (a w) y sus valores oscilan entre 0 y 1
Osmosis: es el proceso por el que el agua difunde desde una regin
de alta cc (baja en soluto) a una regin de baja cc (alta en soluto)
Plasmlisis: se produce cuando la clula est en ambiente con baja
actividad del agua y existe una tendencia de salida del agua intracelular

NECESIDADES DE OXIGENO
Bacterias aerbicas estrictas: utiliza concentraciones del 20% ms
de Oxgeno
Metabolismo : Alimento + O 2 Material celular + CO2 + H2O
Microaerfilos: necesita concentraciones muy bajas de Oxgeno. 210%. Tienen superxido dismutasa (SOD) y pueden o no tener catalasa
Bacterias anaerbicas estrictas: No tolera nada de Oxgeno. Les
resulta txico y mueren, solo crecen si hay 0.5%. No tiene ni SOD ni
catalasa
El oxigeno es un txico, su metabolismo es:

Bacterias anaerbicas facultativas: utiliza oxgeno solo si lo hay. No

tiene problema para sobrevivir pero si hay oxgeno crece ms rpido, 28%, tienen SOD y catalasa
Anaerobio aerotolerante: no necesita oxgeno para crecer y
multiplicarse. Tolera el oxgeno pero no lo utiliza. Tienen SOD pero no
catalasa

NECESIDADES DE OXIGENO
El Oxgeno es txico para algunos porque no tienen las enzimas

SOD y catalasa, que degradan a los radicales libres del Oxgeno que
son txicos. Con estas enzimas (SOD y Catalasa), las bacterias
pueden vivir con oxgeno
El consumo de oxgeno es necesario para la respiracin celular
(para obtener ATP)
Toxicidad del Oxgeno: elementos txicos:
H2O2: Perxido de Hidrgeno
O2- : radical superxido
OH- : radical hidroxilo
Enzimas que intervienen:
Superxido dismutasa: 2 O2 + 2 H+------H2O +O2
Catalasa o peroxidasa: H2O2--------------H2O + O2