Vous êtes sur la page 1sur 106

ESTUDIO CITOGENTICO :

I. Cultivo Celular
II. Anlisis Cromosmico

Lic.TM. Hctor Herrera Reynoso


Esp: Citogentica y Biologa Molecular

CULTIVO CELULAR
Los cultivos celulares son un
procedimiento tecnolgico de
mantenimiento y estudio de
clulas vivas en un medio
artificial que permite reproducir,
de manera bastante fiable, las
condiciones biolgicas que las
clulas tienen en su lugar de
origen.
Potencialmente todas las clulas
son cultivables, pero cada una de
ellas presenta peculiaridades y
requerimientos especficos.

Cultivo Celular: Estudio Citogentico


MEDIOS DE CULTIVO CELULAR
Son compuestos que contienen : Todos los aminoacidos,
vitaminas,cofactores, coenzimas, enzimas, sales, iones,
indicadores de pH.
Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionan
dependiendo del tipo de muestra tipo de clula a cultivar
y
lograr que estos respondan adecuadamente con un
crecimiento
celular.
Los medios de cultivo celular se seleccionan dependiendo
del tipo de estudio citogentico a realizar (Cultivo de alta
resolucin, Estudio de fragilidad cromosmica, etc) o del
tipo de anomala cromosmica a demostrar (Estudio de X
frgil).

Cultivo Celular: Estudio Citogentico


ESTUDIO
CITOGENETICO

MEDIO DE
CULTIVO BASE

MEDIO DE
CULTIVO
ESPECIFICO

SANGRE
PERIFERICA

RPMI 1640, Mc
CoyS Modified, Tc
199

PB Max Karyotiping
Medium, Createst
Lynfocitos

MEDULA OSEA

RPMI 1640, Mc CoyS


Modified

Marrou Max
Karyotiping
Medium

LIQUIDO AMNIOTICO

HAM F-10, HAM F-12

AMNIOMAX, Chang
B+C

RESTOS
ENDOUTERINOS

HAM F-12, HAM F-10

AMNIOMAX, Chang
B+C

PIEL

RPMI 1650

Chang B+C

Cultivo Celular: Estudio citogentico


SUPLEMENTOS
.- Adems del medio de cultivo base, las clulas requieren para
su
crecimiento y divisin celular de suplementos, los cuales sern
utilizados dependiendo del tipo de clulas que se desea
cultivar y
del tipo de estudio citogentico requerido.
1.- SUERO BOVINO FETAL (SBF) : se utiliza a diferentes
concentraciones: 5% para el estudio de cromosoma X frgil
20% para el cultivo de SP y MO
30% para el cultivo de clulas fetales
30% para el cultivo de tumores
2.- PENICILINA + ESTREPTOMICINA: utilizado como antibiticos
para evitar la contaminacin bacteriana.
3.- ANTIMICOTICOS: como la Fungizona para evitar el crecimiento
de hongos, si es que fuera necesario.

Cultivo Celular: Estudio Citogentico


SUPLEMENTOS:
4.- L- GLUTAMINA: Es un aas que en su forma levgira mejora el
crecimiento celular.
5.- ESTIMULANTE MITOGENICO: Utilizado para estimular el proceso
de mitosis en el cultivo de linfocitos. Como:
- Fitohemaglutinina (PHA)
- Concavalina A (ConA)
- Pockeweed Mitogen
Adems se utilizan suplementos o reactivos especficos cuando se
requieren realizar estudios citogenticos especiales como:
.- Estudio Cromosoma X frgil: Se cultiva la SP (linfocitos) en medio
TC 199 RPMI 1640 pero deficientes en cido flico, ms Lglutamina
bien utilizando la Fluorodeoxiuridina (FUdR) Metotrexate
(MTX)
que son inhibidores de las enzimas que participan en la sntesis
de
novo del cido flico.

Cultivo Celular: Estudio Citogentico


Medios de
Cultivo
y Suplementos

Formas de

presentacin
diferentes.
. Medio Lquido y
en
polvo
. Microcultivo

Cultivo Celular: Estudio Citogentico


Preparacion de
los
Medios de
Cultivo
. Pesar el medio
. Diluir en agua
destilada
. Agitar
. Aadir Suplementos
P+S
L-Glutamina
SBF
. Ajustar el pH

Cultivo Celular: Estudio Citogentico


Esterilizacin de los Medios
de Cultivo
. Sistema de filtracin al vacio
. Filtros millipore 0,22um
. Bomba de vaco
. Alicuotar en frascos estriles
. Control de esterilidad en estufa a
37C por 48 hrs.

TECNICAS DE
ESTUDIO
CITOGENETICO

Algo de historia
J.H.Tjio

(1956)
Lejeune
(1966)

primer mapa de los patrones de bandas G


de cromosomas humanos publicado (1971)
grupos
cromosmicos

Pateau
(1961)

Tcnica Convencional

Bandeo Cromosmico: Bandas GTG

Cariotipo humano: 46 XY

DNA
replication

metaphase

chromosomes
condense

nuclear
envelope
breaks
down

chromosomes
alignedon
spindlefibers

Tcnicas de Estudio Citogentico

Estudio Citogentico: Estudio


Cromosmico
Clulas estn divisin celular (Mitosis)
Anlisis cromosmico (morfologa y patrn de bandas)
en Metafase.
Algunas clulas normalmente en proceso de
proliferacin y
diferenciacin por lo que NO necesitan de un
estimulante mitognico
para que entren divisin.
Otras clulas ya diferenciadas requieren de un
estimulante mitgeno
para que entren en mitosis.
Cultivos Indirectos y Cultivos Directos
Cultivos a corto plazo y cultivos a largo plazo

Cultivo Celular

A.- Cultivo Celular Indirecto


1.- Cultivo de Linfocitos
.- Cultivo a corto plazo (72 horas)
.- Muestra: Sangre Perifrica
.- Se realiza para detectar cualquier
alteracin cromosmica constitucional.
.- Se utiliza para detectar las
autosomopatas (Sindromes Down,
Patau, Edwards, etc) y las
Gonosomopatias (Sndromes de Turner,
Triple X, Klinefelter, etc)

Tcnica de cultivo de linfocitos


(sangre perifrica)
Toma de muestra

Siembra

Cosecha

Preparacin de laminas

Coloracin y observacin metafases

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
Toma de Muestra
. Condiciones de ascepcia
. Anticoagulante heparina
. Volumen de muestra

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
Eliminar el paquete
de GR dejando la
interfase y el
plasma.
La mezcla de la
interfase
(Linfocitos)
con el plasma.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
Volumen del medio
de cultivo (5-10 ml)
Mayor esterilidad
posible.
Frascos de cultivo
(Falcon flask,
vidrio)

RPMI-1640 es un medio de
cultivo que fue desarrollado
por Moore et al. en el Roswell
Park Memorial Institute, de
ah el acrnimo RPMI. Este
medio contiene una gran
cantidad de fosfato y est
formulado para su uso en una
atmsfera de dixido de
carbono 5%.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
Volumen de muestra
Mezcla de Interfase
plasma 1.0 1.5 ml
Sangre total 0.5 ml
30 gotas.
Microcultivo V gotas.
Mezclar suavemente e
incubar

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
Incubar a 37c por
70 a 72 horas

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
Despus de las 72
horas sacar el
frasco de cultivo
la estufa.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

COSECHA
1. Colchicinizacin
. Agregar Colchicina
0.1 ugr/ml : 50 100
ul.
. Mezclar suavemente
. Incubar

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
Incubar a 37C por
50 a 60 minutos

El colcemid es un anlogo de
la colchicina que
despolimeriza los
microtbulos del
citoesquelto, impidiendo la
formacin del huso mittico, y
por lo tanto bloqueando la
mitosis en la etapa de
metafase

Por su unin
reversible con la
tubulina
citoplasmtica
impide su
polimerizacin
dentro de los
microtbulos
celulares, quedando
inhibida la metafase
de la divisin celular.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

Sacar el frasco de la estufa,


trasvasar a un tubo y
centrifugar

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
. Centrifugar a 1000 rpm por l0 . Con una pipeta pasteur eliminar el
minutos.

sobrenadante.
. Trabajar siempre con el sedimento

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
2. Hipotonizacin
. Adicionar solucin
hipotnica: Cloruro
de Potasio 0.075 M

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
. Adicionar 6 ml de ClK
0.075M
. Agitar con pipeta pasteur

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
. Incubar a 37C
por
10 a 15 minutos.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

3.- PREFIJACION: Sacar el tubo de la estufa y agregar


10 gotas de fijador. Solo para parar la accin de la
solucin hipotnica. Centrifugar a 1000 rpm por 10
minutos

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
4. FIJACIN:
. Adicionar Fijador (5ml)
. Fijador: Metanol (1Vol) +
Acido Actico Glacial
(1Vol)

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

. Adicionar 5 ml de
fijador
. Mezclar con pipeta
pasteur
. Dejar a TA por 20
minutos
o dejar en refrigeracin
a
+ 4C por das a
semanas.
. Centrifugar

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
El sedimento se resuspende
. Se realizan 2 3 lavados
con 1 a 2 ml de fijador.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
5. Preparado
Cromosmico
. Adicionar 3 a 4 gotas sobre
una lmina portaobjetos
helada.
. Secar al calor de un
mechero.
. Guardar en una gradilla

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
Cromosomas sin bandeo
Cromosomas con Bandas G

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)
Elaboracin del Cariograma

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA


(LINFOCITOS)

ANALISIS CROMOSOMICO

Patrn de Bandas GTG de


Cromosomas

Cultivo Celular
B. Cultivo Celular Directo:
1.- Cultivo de Lquido Orgnico:
.- No se hace un cultivo celular propiamente dicho
.- Se realiza directamente un choque hipotnico de
las clulas y posterior fijacin.
.- Permite demostrar alteraciones cromosmicas
numricas y/o estructurales que indican la
presencia de clulas neoplsicas.
2.- Cultivo de Mdula Osea:
.- Cultivo a corto plazo (24-48-72 horas)
.- Muestra: Aspirado de Mdula Osea
.- Realizado para el estudio cromosomico en
pacientes con
desordenes mieloproliferativos (Sndromes
Mielodisplsicos,
Leucemias)

Estudio Citogentico de Lquidos


Orgnicos
Obtencin de la Muestra
Volmen de Obtencin
Anticoagulante Heparina
Conservacin de la
Muestra
Caractersticas Fsicas
Color
Aspecto

Criterios de Malignidad
1. Alteraciones Numricas (ploida)
Hipodiploida : N Cr < 46
Hiperdiploida : 69 > N Cr > 46
Poliploida :
N Cr > 69

Estudio Citogenetico de Liquidos


Orgnicos
2. Alteraciones Estructurales
.- Ring,Translocaciones, deleciones, etc.
.- Cromosomas marcadores (mar)
.-Dobles minutes (Dm)
.- Figuras Trirradiadas, Tetrarradiadas.
.- Rupturas Cromosomicas (gap,cap)

CULTIVO DE MEDULA OSEA

CULTIVO
MEDULA
OSEA

Cultivo Celular
3.- Cultivo de Piel
.- Cultivo largo plazo (14-21 das)
.- Muestra: Biopsia de piel (Cultivo de fibroblastos)
.- Realizado generalmente cuando se sospecha de un
mosaicismo cromosmico no detectado en Cultivo de
Linfocitos.
4.- Cultivo de Tumores:
.- Cultivo largo plazo (14-30 das)
.- Muestra: Biopsia del tumor la pieza quirrgica del
tumor
.- Realizado para demostrar la presencia de una
alteracin numrica y/o estructural de los cromosomas
que estn asociados a la presencia de clulas tumorales
clulas neoplsicas.
.- Brindan informacin sobre el diagnstico, estadiaje,
pronstico y evaluacin del tratamiento de los tumores.

Cultivo Celular
5.- Cultivo de Clulas Fetales
.- Cultivo a largo plazo (10-14 das)
.- Muestra: Liquido Amnitico obtenido por Amniocentesis
alrededor
de la 16 semana de gestacin.
.- Se efecta para hacer el diagnstico prenatal de una alteracin
cromosmica.
6.- Cultivo de Vellosidades Coriales:
.- Cultivo corto plazo (24 48 horas) y Cultivo largo plazo (10-14
dias)
.- Muestra: Biopsia aspiracin de Vellosidades Corinicas
alrededor de la 10 semana de gestacin.
.- Se efecta para hacer el diagnstico prenatal de una alteracin
cromosmica.
7.- Cultivo de Restos Endouterinos:
.- Cultivo largo plazo (10-14 das)
.- Muestra: Legrado uterino y/o producto abortado
.- Se realiza para detectar una anomala cromosmica del
producto.

Imagen en la pantalla del


ultrasonido

Amniocentesis

Cultivo de Vellosidades
Coriales

Cultivo de vellosidades
coriales
Biopsia transcervical

Biopsia transabdominal

MUCHAS GRACIAS
herrerahh7@yahoo.es

BANDEO CROMOSOMICO
Existen varias tcnicas de
bandeo cromosmico, que nos
permiten identificar individualmente
los cromosomas, lo cual facilita la
identificacin de una alteracin
cromosmica
numrica
y
especialmente
demostrar
la
presencia
de
alteraciones
cromosmicas estructurales.

Permite precisar la localizacin de genes aportando


informacin al llamado mapeo gentico.
Tener
un mayor conocimiento acerca de la
estructura cromosmica y de los reordenamientos
que se producen en las distintas alteraciones tales
como:
Fusiones y fisiones cntricas
Translocaciones recprocas y en tandem
Inversiones peri y paracntricas
Deleciones
Duplicaciones
Constricciones secundarias
Fracturas cromosmicas, etc.

BANDAS CROMOSMICAS
Los bandeos cromosmicos pueden
clasificarse en morfolgicos y dinmicos:

A.-LOS BANDEOS MORFOLGICOS:


se obtienen basndose en tcnicas
inherentes a la heterogeneidad de la cromatina.
Existe una relacin con protenas (histnicas y no
histnicas) e interacciones ADN. A su vez
clasificados en:
Tcnicas de tincin diferencial
Mtodos de tincin selectiva
Coloracines con fluorocromos especficos
aislados o combinados con colorantes no
fluorescentes y
tinciones con Anticurpos fluorecentes.

B.-LOS BANDEOS DINMICOS:


Basados en: tcnicas que implican la

incorporacin de una base anloga, bromodeoxiuridina (BrdU), en el ADN durante la fase S


del ciclo celular. Se denomina tambin bandeo de
replicacin debido a la relacin existente entre el
tiempo de incorporacin del BrdU y el patrn de
replicacin.
Al incorporar BrdU durante la fase de
replicacin temprana se obtiene un patrn de
bandeo R destacndose las regiones ricas en G-C.
Luego , los cromosomas pueden visualizarse
utilizando distintos mtodos de tincin que
emplean colorante como el Giemsa o el naranja
de Acridina o utilizando Anticuerpos especficos.

TIPOS DE BANDEO CROMOSOMICO


Tcnicas
Tcnicas
(GTG)
Tcnicas
Tcnicas

de bandas Q
de bandas G
de bandas R
de bandas C

Tcnica de bandas Q
Fue la primera metodologa de bandeo
cromosmico ( llamado as por la
sustancia fluorescente empleada la
quinacrina)
1970, Casperson y colaboradores la
desarrollaron.
1971 - (Conferencia en Paris) fue
denominada como la tcnica de banda Q.

UTILIDAD
Demostrar la porcin distal del brazo largo del
cromosoma Y que se tie con mas intensidad que
los dems cromosomas.
Las
regiones
pericentromricas
de
los
cromosomas 3 y 4 , y las regiones satelitales y
pericentromricas
de los cromosomas
acrocntricos muestran variaciones significativas
conocidos como polimorfismo o heteromorfismos
demostrados con estas tcnicas.
La fluorescencia mayor depende del ADN, si la
regin es mas rica en adenosina y timina (A-T)
habr mayor fluorescencia, pero si es el ADN rico
en (G-C) la fluorescencia tiende a apagarse.

DESVENTAJA
Es el uso de la fluorescencia , que
despus de que es usada desaparece
progresivamente y es por ello que la
observacin, el anlisis cromosmico as
como la toma de microfotografa debe ser
rpida
para
su
observacin
en
el
microscopio.

SOLUCIONES:
1.
2.

Buffer Sorensens a
pH 5.6
Colorante
Dihidrocloruro de
Quinacrina al 1%

PROCEDIMIENTO :
1.

Se tien las lminas con el


colorante de Quinacrina por
15 a 20 en oscuridad.
2. Se lavan las lminas con Buffer
Sorensens.
3. Se monta con una laminilla con
el Buffer.
4. Examinar al microscopio de
fluorescensia utilizando una luz
de longitud de onda de 450 a
500nm

Bandeo Q (quinacrina)

Tincin con Mostaza de quinacrina


Bandeo Q

Tecnica de bandas G
La tcnica de bandas G ( Giemsa )
obtenidas por digestin proteoltica con
el uso de la enzima tripsina, es la mas
usada y considerada como una tcnica
estndar.
Es una tcnica conocida como GTG
(Bandas G por tripsina usando Giemsa),
es un mecanismo aun no aclarado.

Tecnica de
bandas G

Clark y Coleg.

Histonas ricas
en Arginina
En las bandas GTG

No tanto con la
perdida de
ADN y proteina de
cromosomas durante
el tx con tripsina

Dos tipos de
bandas

Bandas G +
(oscuras)
Relativamente
ricas en prot.
Disulfuro

Bandas G (claras))

Distribucin de las prot.


Cromosmicas y de ADN

Sulfihidrilos

El patrn de bandas es similar entre


(G-Q)
Es de uso rutinario
La banda G obtenida por GTG es
muy superior en la
resolucin,comparada con aquellas
tcnicas que utilizan Fluorocrmos.

SOLUCION :
1.
2.
3.

Solucin de trIpsina al 1%
Solucin salina fisiolgica
Colorante Giemsa 4%

PROCEDIMIENTO :
1.
2.

3.
4.
5.

Se coloca en bao Maria a


37C el frasco N 1 de
solucin de tripsina 1%
Se coloca las lminas con
la preparacin
cromosmica (menos de
una semana) en el frasco
N1 x 10.
Enjuagar las laminas en el
frasco N2 de solucin
salina fisiolgica.
Se colocan las laminas en
el frasco N3 de colorante
Giemsa 4% x 6 a 8.
Lavar con agua corriente
y dejar secar y observar
en el microscopio.

. Bandeo GTG:
- Tripsina 1%
(buffer)
- Solucin Salina
Fisiolog.
- Giemsa 4%

bandas G-plidas

bandas G-oscuras

DNA rico en GC

DNA rico en AT

replicacin temprana

replicacin tarda

Muchos genes

Pocos genes

Esta imagen
muestra cada
cromosoma
humano normal
comparado con
su idiograma, o
mapa, de
bandas G, un
esquema
acordado
internacionalm
ente para los
patrones de
bandas.

Tcnica de bandas R
Se hace el tratamiento de las laminas a
altas temperaturas en varios buffer
Tincin con Acridina Oramge o Giemsa
Las bandas que producen estas tcnica en
los cromosomas humanos son el reverso
de bandas G o Q es decir que las bandas
claras en Q o G son bandas oscuras en R.

VENTAJAS
Que la regiones telomricas
de los
cromosomas son mas
teidas, a
diferencia de las tcnicas de bandas Q y
G en las que no son tan claras.
El
tratamiento
con calor
induce
denaturacin
de las protenas
cromosmicas
as
como
de
las
secuencias
del
ADN
ricas
en
nucletidos(A-T), mientras que el ADN
rico en G-C de las bandas R en una
configuracin nativa.

SOLUCION:
1.
2.

Buffer
sorensens(0.06,pH6.59)
Colorante de Giemsa.

PROCEDIMIENTO :
1.

2.

3.
4.
5.

Preparar el buffer
sorensens en un koplins
y llevar a bao Maria
85C
Colocar las lminas
preparadas(1-2 sem) en
el buffer sorensens
durante 10.
Lavar las laminas de
buffer S.
Colocar en colorante de
Giemsa por 5.
Lavar, dejar secar y
observar al microscopio

CROMOSOMAS HUMANOS: BANDAS RGT

Bandas R
-til para teir
los extremos
distles de los
cromosomas
(deleciones o
reorganizaciones
distales)

Propiedades diferenciales entre las bandas


GyR
G
Composicin
bajo contenido G+C
contenido G+C
Replicacin
tarda
Secuencias repetidas
Line (L1)
Quiasmas
Raros
N de genes
Escaso
Clase de genes
Especficos

R
Alto
temprana
Sines (alu)
Abundantes
Abundantes
Domsticos

Tecnica de bandas C
La tcnica de bandas C produce una
tincin selectiva de la heterocromatina
constitutiva
,estas
bandas
estn
localizadas
en
la
regin
pericentromrica de los cromosomas
humanos.
1971- Fue un mtodo descrito por Arrighi
y Hsu.

APLICACION
Demuestra variacin de tamao de la regin
de heterocromatina constitutiva presente en
las
regiones
pericentromricas de los
cromosomas.
Para los cromosomas 1,9,16 y brazos largos
del cromosoma Y.
Polimorfismos.
Inversiones pericentromricas.

Tecnica de
bandas C

Desnaturalizar

Extraer el material
cromosmico
Incubado en
solucin salina

GIEMSA

Alcali

SOLUCION :

HCL 0.2N
Ba (OH)2 5%
Solucin saluria de
citrato de
sodio(2xSSC)
Giemsa

PROCEDIMIENTO :

Tratar la laminas con HCL 0.2N X


20 a T ambiente
Lavar lamina con H2O destilada.
Tratar las laminas con sol.
Ba(OH)2 al x 5%x 1a2.
Lavar con H2O destilada hasta
eliminar el exceso de bario.
Colocar las laminas en soluc. 2 x
SSC a 60C X 2 horas .
Lavar con H2O destilada
Teir con Giemsa 5% en Buffer
sorensens a pH 7.0 x 15
Lavar con H2O destilada y
observar al microscopio.

Bandeo C tie
especficamente
regiones centromricas

DETERMINACION DEN N DE BANDAS


CROMOSOMICAS

MUCHAS GRACIAS
herrerahh7@yahoo.es