Diplomado de

Biologa Molecular

Equipo # 3: ESTUDIOS SOBRE LA

NATURALEZA QUMICA DE LA SUSTANCIA
QUE PROVOCA LA TRANSFORMACIN DE
TIPOS NEUMOCOCOS

La transformacin en Pneumococcus es uno

de los ejemplos mas asombrosos de
alteraciones heredables en la estructura
celular que puede ser reproducido e inducido
experimentalmente

1928- Griffth: Transformacin in vivo

Objetivos
Analizar detalladamente el fenmeno de
la transformacin de tipos especficos de
Pneumococcus.
Transformar una variante no encapsulada
R tipo II en una variante tipo III (S).
Aislar el principio activo a partir de
extractos de bacterias e identificar
su naturaleza qumica.

Experimento

La transformacin de los tipos de neumococo in-vitro requiere de

ciertas condiciones de cultivo que sean cumplidas antes es posible
mostrar la reaccin incluso en la presencia de un potente extracto
Caldo nutritivo. Caldo infusin cerebro bobino conteniendo
1% de neo peptona sin contener dextrosa y ajustado a un pH
inicial de 7.6-7.8
En anti R neumococo de conejo fue usado debido a la
observacin de la reversin de un neumococo R del homologo S
puede ser inducido por el crecimiento que contiene anti R suero.
Extracto R (R36A) la sepa no encapsulada R utilizada en el
presente estudio se deriva de un cultivo S del neumococo tipo II

Mtodo de titulacin de la actividad

transformacin
Esterilizacin
del
extracto
celular
de
Pneumococcus tipo III
Precipitado se redisuelve en solucin salina
Agregado de suero previamente calentado a 60
C
Extracto esterilizado es diluido seriadamente y
se lo agrega al caldo
Incubacin a 37 C durante 18 24 horas

Propiedades anti-R presentes en el suero causan

que las R aglutinen y formen grumos que
sedimentan en el fondo del tubo dejando el
sobrenadante traslucido.
Cuando ocurre la transformacin, las S capsuladas
no son afectadas por los anticuerpos anti-R, por lo
que no aglutinan y crecen difusamente en todo el
medio.
La inspeccin visual permite entonces determinar
si ocurri o no transformacin
Igualmente se realizan cultivos en placa con agar

MTODOS PREPARATIVOS
(1)
2.Extraccin de las clulas
1.
Material
Cepa
original:

Pneumococcos Tipo III

(A66)
Cultivos en lotes de 50-75
litros
Centrifugacin en fro (evitar
autolisis)
Clulas resuspendidas y
calentadas a 65 C
inactivacin de enzima
intracelular que destruye al
principio transportador.

muertas

Extraccin con solucin

salina + desoxicolato
sdico 0.5%
Precipitacin con alcohol
etlico absoluto.

MTODOS
PREPARATIV
OS (2)
3.Desproteinizacin y
remocin del
polisacrido capsular

Desproteinizacin
con cloroformo.
Digestin con
enzima
4.Fraccionamiento
del material con
Etanol

ANLISIS DEL MATERIAL

PURIFICADO
(1)
Caractersticas generales:
Soluciones salinas de 0.5 a 1.0 mg/mL son
incoloras. Son viscosas y turbias (a luz transmitida).
Conservacin:
en solucin salina fisiolgica, 2-4 C -- 3 meses.
Soluciones salinas, congelacin (-70 C) -- muchos
meses.
El material parcialmente purificado puede
preservarse liofilizado.
La actividad del principio transformador en
extractos crudos soporta calentamientos de 30-60
minutos a 65C.
La inactivacin ocurre a pH de 5 o ms bajo.

ANLISIS DEL MATERIAL

PURIFICADO
(2)
Pruebas qumicas:
Prueba
Biuret y Million
Reaccin de la
difenilamina de
Dische
Bial

Grupo funcional
RESULTADOS
a detectar
Protenas
Negativos
Presencia de cido Positiva
desoxirribonucleico
cido ribonucleico

Positivo dbil

ANLISIS DEL MATERIAL

PURIFICADO
(3)
Anlisis Qumico Elemental
- Nitrgeno (N), Fsforo (P),
Carbono (C), Hidrgeno
(H)
- La proporcin N/P --- su
promedio 1.69 coincide
con el calculado para un
desoxirribonucleico.

ANLISIS DEL MATERIAL

Tripsin
PURIFICADO (4)
a
Quimotripsi
na

Anlisis Enzimtico

Ribonucleas
a
Fosfatasas,
estereasas
Desoxiribon
ucleasa

Greenstein y Jenrette demostraron que los extractos

de tejido incluyendo la leche y el suero de varias
especies de mamferos contienen un sistema de
enzimas
que
son
las
causantes
de
la
despolimerizacin del Acido Desocirribonucleico.
Aplicando el mtodo de Greenstein para cuantificar
de la actividad de la sustancia de transformacin
con una temperatura de incubacin de 37 en
suero fresco de perro y conejo

T = 65
C
t = 30
min

T = 60
C
t = 30
min

Patr
n

TABLA III: Inactivacin diferencial por calor de las

enzimas en el suero de perro y de conejo que
destruyen la substancia de transformacin

A partir de los datos

presentados en la Tabla III, es
evidente que el suero que se
utiliz como patrn de perro y
de conejo son capaces de
destruir completamente la
actividad de transformacin.

T = 60
t = 30 min

T = 65
t = 30 min

T=0

T = 60
t = 30 min

T = 65
t = 30 min

T=0

Anlisis
Serolgico.
En el curso de la purificacin del principio activo
se encontr que su actividad serolgica en
antisuero tipo III fue disminuyendo, sin la
correspondiente perdida de la actividad
transformante

Estudios Fisicoqumicos

Anlisis
por
ultracentrifugacin:
Sustancia
homognea
Electroforesis: componente nico de gran movilidad
comparable con el de un acido nucleico
Curvas de absorcin UV: mximos cercanos a 260
nm, caractersticos de los cidos nucleicos

Cuantificacin de la actividad
biolgica
Titulacin a partir de una preparacin que haba
sido purificada a bajas temperaturas
Mnima cantidad necesaria de material activo para
inducir la transformacin 0.003g

DISCUSIN
El Factor de Transformacin es una sustancia de
naturaleza qumica que se desconocia pero si se sabia
que era transferida desde los neumococos S muertos a
los neumococos R vivos. Este factor de transformacin
convistio a los neumococos R en neumococos S con la
capsula de polisacridos que les hace letales.

 Es sorprendente el hecho de que las sustancias que

provoca la reaccin y la sustancia capsular producida en
respuesta a la misma, sean qumicamente distintas, ADN
y Polisacrido.
Los eventos bioqumicos subyacentes al fenmeno
sugieren que el principio transformar interacta con la
clula R, dando lugar a una serie de reacciones
enzimticas que culminan en la sntesis de la capsula del
tipo III. Estas nuevas caractersticas son transmitidas a la
descendencia.

CONCLUSIONES DEL GRUPO

La evidencia presentada soporta la creencia que una
acido nucleico del tipo desoxirribosa es la unidad
fundamental del principio de transformacin del
pneomococcus tipo III
Avery, MacLeod y McCarty demostraron la naturaleza
qumica del ADN, y que era el responsable de llevar toda
la informacin gentica que precisan los seres vivos.
Que los resultados del experimento demostraron que la
informacin
gentica
es
capaz
de
convertir
pneomococcus tipo R en tipo S, bajo condiciones
controladas.