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microRNAs

Silvia Juliana Serrano Gmez BSc, MSc


Coordinadora FICMAC-Lab

Dogma central de la biologa molecular

TRANSCRIPCIN Y TRADUCCIN
ARN: Acido Ribonucleico
Tipos de ARN
mARN: Mensajero
Ribosomal RNA (rARN)
tranferenciaRNA (tARN)

ADN Vs. ARN


ACIDOS NUCLEICOS: Grupo fosfato, azcar y base nitrogenada.

Transcipcion genica

ADN molde
Regin de transcripcin - Promotor
Factores de transcripcin
ARN Polimerasa

Generacin de mARN

Splicing del mRNA

Generacin de mARN

Traduccin del ARN

Que es un microRNA?
Familia de pequeos
ARNs (Small RNAs)
Secuencias de cadena
sencilla no codificantes de
ARN de aproximadamente
22 nucleotidos (nt) que
regulan la expresin
gnica.

Pasos para la generacin de un


microRNA
1. Gen codificante de microRNA
Transcrito de 70nt
2. Pre-miRNA forma estructura de
tallo-orquilla (Stem-loop)
3. Pre-miRNA es procedaso por
DICER en un miRNA de 21
25nt

microRNAs
Como regulan la expresin gnica?
1. miRNA tiene complementariedad perfecta a secuencia
target degradacin del mRNA: RNAi
INHIBICION A NIVEL TRANSCRIPCIONAL

2. Unin imperfecta del miRNA al mRNA


INHIBICION A NIVEL POS-TRANSCIPCIONAL
(TRADUCCION)

Como regular la expresin gnica


Biognesis de los microRNAs

Precursor largo
RNAse III
70 nt
RNAi

RNAse III

Regulacin
gnica

Unin parcial por el


3UTR del mRNA

microRNAs
Caractersticas

ALTERACIONES
A NIVEL DE
TRANSCRIPCI
N

DURANTE EL
PROCESAMIEN
TO DEL MIRNA

Annu Rev Pathol. 2009 ; 4: 199227

Supresores tumorales y oncogenes

NO-Bloquea
transcripcin de
oncogn

Bloquear
transcripcin de
supresor tumoral

Generalidades microRNAs en cncer


Secuencias corta de RNA (~22-5pb)
Actan a travs que un complejo supresor (RISC)
Degradacin del mRNA blanco
Represin de la traduccin
Un dao en le procesamiento del miRNA se puede traducir en
predisposicin a cncer

microRNAs en gliomas

miRNAs y expresion en gliomas


miR-21
Determinacin de niveles de miR-21

qRT-PCR

Northern blot

Proliferacin microvascular: Reorganizacin de la matriz extracelular y capacidad de proliferacin

Rutas moleculares afectadas por miR-21


Ensayos usando anti-miR-21

Blancos
miR21

Apoptosis
Proliferacin
Invasin
Migracin

En Apoptosis
RUTA DE P53

RUTA DE TGF
Citoquina inhibidora
del crecimiento

Estabilizar p53

Ruta de metaloproteinasas de matriz (MMP)

MMP: PEPTIDASAS DEGRADACIN MATRIZ


EXTRACELULAR
NIVELES AUMENTADOS EN GLIOMAS

Ruta mediada por PDC4

EFECTOS SOBRE LA PROLIFERACIN

mi-R21 y respuesta a quimioterapia (taxanos)

Niveles de expresin de miR-21 por RT-PCR


Regulacion de miR-21 por su inhibidor

Inhibidor del miR-21 incrementa la citotoxicidad


del taxol

Inhibicin en un 50% del crecimiento celular Vs. Concentracin


taxol-inhibidor

Taxol + Anti-miR-21

Anti-miR-21

Taxol

Taxol + Anti-miR-21

Anti-miR-21

Taxol

Actividad de AKT: Contribuye a supervivencia


Ensayos Western-Blot

Reduccin de la expresin de p-AKT usando combinacin del


inhibidor y quimioterapia

miRNAs y apoptosis
24,68%
21,75%

6,24%

18,74%

6,24%

Aumento de muerte celular por apotosis Efecto aditivo

21,97%

miR-21 y resistencia temozolamida

Ensayos de viabilidad celular

Tratamiento con miR-21 hace clulas resistentes a


tratamiento con TMZ

Ensayo de apoptosis

TMZ: Induce apoptosis


miR-21: Disminuye porcentaje de apoptosis

Cascadas de sealizacin Bax/Bcl2

Bax: promotor de apoptosis, Bcl2: inhibidor de apoptosis

Aumento relacin Bax/Bcl2: Promueve apoptosis


Disminucin de la relacin Bax/Bcl2 contribuyen a resistencia a terapias

Medicin niveles Bax y Bcl2 por


western blot

Expresin relativa del radio


Bax/Bcl2

miR-7 y proliferacin

Primeros en reportar que miR-7 regula el EGFR


Baja regulacin de miR-7 en glioblastoma

Va del EGFR-AKT

EGFR y AKT juegan un papel central


en los Glioblastomas

Inmunoblot de EGFR

Decrecimiento en la expresin de EGFR y de AKT

Inmunoblot de AKT: fosforilacin en Ser173

IRS-1/IRS-2 contienen sitios de unin del miR-7

EGFR regula la actividad de AKT PERO, la inhibicin de AKT


por miR-7 es dependiente de la inhibicin de EGFR?

miR-7 suprime la activacin de AKT


INDEPENDIENTEMENTE de la inhibicin del EGFR

Conclusiones (1)

Los microRNAs son molecular de cadena sencilla de aproximadamente 20 nt que


regulan a expresin de diferentes genes

Dos mecanismos de regulacin:


iRNA
microRNA

La gran mayora de los miRNAs conocidos estas localizados en sitios frgiles


asociados con cncer

Daos en el procesamiento del miRNA esta relacionado con el desarrollo de


cncer.

Conclusiones (2)

mirR21 es un oncogn sobre-expresado en glioblastomas y se


encuentra asociado con resistencia a agentes quimioteraputicos
APOPTOSIS
microRNA-7 (miR-7) es considerado un supresor tumoral que se
encuentra sub-regulado en glioblastoma y suprime la expresin de
EGFR y AKT PROLIFERACIN CELULAR
Representan un blanco teraputico Uso de antagonistas