Vous êtes sur la page 1sur 75

EJERCICIOS

Sesenta microlitros de una solucin de ADN se


diluyen en agua hasta obtener un volumen final
de 500 L. La muestra diluida tiene una
absorbancia a 260 nm de 0,142. Determinar la
concentracin de la solucin stock de ADN en
ng/mL.

Una solucin de ADN tiene una absorbancia a 280


nm de 0,212 y una pureza de 1,9. Encontrar la
cantidad de ADN en 30 microlitros de la solucin
expresada en mol, si 1 mM equivale a 6,7 D.O.

I
C
A
Z
I
R
S
E
O
T
C CID
Y
A
R
S

A
O
E
C
C
D LEI
S
A
C
N

U
E
N
T
O
PR
Biotecnologa Mdica 2016
Ing. Betty Salazar Pinto
bettysalazar2211@gmail.co
m

OBJETIVO

Explicar el fundamento, mtodo y


aplicaciones
del
anlisis
y
caracterizacin de cidos nucleicos y
protenas en el diagnstico molecular,
adquiriendo destrezas y habilidades
en el desarrollo de ensayos, valorando
su importancia en el desarrollo de
metodologas en un laboratorio de
diagnstico clnico molecular.

INTRODUCCIN

ENZIMAS DE
RESTRICCIN

TECNOLOGAS DE
HIBRIDACIN

BIBLIOGRAF
A

INTRODUCCIN

Enzimas de
restriccin
Tecnologas de
hibridacin

cidos
nucleicos
Protenas

NUCLEASAS: DEFINICIN
enzima con capacidad de
escindir los enlaces
fosfodister de la cadena
polinucletida de los cidos
nucleicos. Es una
FOSFODIESTERASA

Escisin en
posicin
terminal o
interna
Endonucleasa
s
Exonucleasas

Tipo de enlace
fosfodister

Tipo de
pentosa y
base
nitrogenada
DNAsas
RNAsas

Tipo a
Tipo b

c
e
p
Es

d
a
id
c
if

NUCLEASAS: CLASIFICACIN
ESCISIN EN POSICIN
ESCISIN EN POSICIONES INTERNAS O
TERMINALES
(5) pApBpCpDpEpFpGpHpIpJpKpL
(3)
Accin de
exonucleas
a 5

Liberan el
nucletido
del extremo
5

Accin de
exonucleas
a 3

Liberan el
nucletido
del extremo
3

Accin de
endonucleasa

Cortan en
una posicin
intermedia

Las exonucleasas hidrolizan exclusivamente


enlaces fosfato en los que participa el
nucletido terminal (bien 5o bien 3,
dependiendo de la exonucleasa). Generan,por
tanto, una cadena polinucleotdica acortada y
un nuclesido(N), un nuclesido-monofosfato
(pNoNp)o un nuclesido-bisfosfato(pNp).

Las endonucleasas slo hidrolizan enlaces


internos de la cadena, es decir, sin afectar a
los nucletidos terminales. Generan dos
fragmentos polinucleotdicos.

NUCLEASAS:

CLASIFICACIN

ESCISIN SEGN EL
ENLACE FOSFODIESTER

ESCISIN DEL ENLACE

Nucleasa a:
Hidrolizan los enlaces fosfato
formados con el OH 3. Producen
extremos 3-OH y 5- P
Nucleasa b:
Hidrolizan los enlaces fosfato
formados con el OH 5. Producen
extremos 3-P y 5-OH

ESCISIN SEGN EL
NUCLSIDO

pApGpUpGpUpCpGpCpApUpA

pApGpUp + GpUp + Cp + GpCp +


ApUp+ A

RNAsa I (de pncreas bovino):


Endorribonucleasa de tipo b que acta
slo sobre enlaces en los que el
ribonuclesido del lado 5 es
pirimidnico(C,U).
DNAsa II (de bazo, timo, etc.):
Endodesoxirribonucleasa de tipo b que
hidroliza preferentemente el enlace
entre nuclesidos purnicoy pirimidnico.

pApGpTpGpTpCpGpCpApTpA

pApGp + TpGp + TpCpGp + CpAp + TpA

ENDONUCLEASAS:
CARACTERSTICAS GENERALES
Se llaman tambin nucleasas de restriccin,
endonucleasas de restriccin, enzimas restrictivas o
restrictasas.

Se nombran con tres letras tomadas del gnero y


especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente
y un nmero romano, cuando en una misma variante se
hayan encontrado varias enzimas con distinta especificidad.

HaeIII (Haemophilusaegytius)
Gran especificidad: sitios de reconocimiento del DNA duplx
e hidrlisis de enlaces fosfodister en cada hebra.

Las letras son seguidas a veces por una letra


ms, que identifca el serotipo (variante
antignica).
EcoRI (Escherichia coli cepa RY13)
BamHI (Bacillus amyloliquefaciens cepa H)

ENZIMAS DE RESTRICCIN:
SISTEMA METILACIN-RESTRICCIN
Un mecanismo de defensa contra la entrada de material
gentico de otro organismo.

Para cada enzima de restriccin, una metilasa reconoce


la misma secuencia que constituye el sitio de
restriccin y une grupos metilo(SAM) a determinadas
bases (citocinas y adeninas).

La metilacin de las bases impide la unin de la enzima


de restriccin, por tanto el DNA propio no es hidrolizado.

ENZIMAS DE RESTRICCIN:
TIPO II
Estructuralmente ms simples(dmero) y ms estudiadas en
Ingeniera Gentica (extremos cohesivos).
Endonucleasa tipo a: 3-OH y 5-P
Sitio de restriccin: reconocimiento e hidrlisis de un mismo
enlace en las dos hebras.
Gran especificidad: sitios de reconocimiento son secuencias
cortas de 4 a 6 pb y palindrmicas.
Los extremos de los fragmentos generados son
idnticos, tienen la misma secuencia (simetra del
palndromoy de la posicin simtrica de los puntos de corte
en cada hebra).

Extremos resultantes de la accin de enzimas


de restriccin.

Fragmentos generados con una misma enzima de restriccin a


partir de dos DNAs distintos puede interaccionar mediante el
apareamiento de las bases de sus extremos cohesivos.
Asociar los fragmentos producidos por enzimas distintas que
producen extremos compatibles

Ms utilizadas en Ing. Gentica:


Extremos compatibles: distintas enzimas generan
extremos cuyo saliente tiene la misma secuencia.
Isoesquizmeros: Dos o ms enzimas que reconocen la
misma secuencia, pueden cortar en el mismo punto en
puntos distintos de esa secuencia.

HIBRIDACIN DE CIDOS
NUCLEICOS
INGENIERA
GENTICA
PATOLOGA
MOLECULAR

BIOLOGA
MOLECULAR

Bases
moleculares

Aplicaciones

Mtodos de
ensayo

INTRODUCCIN
La hibridacin se basa en el proceso de renaturalizacin

Hbridos DNA-DNA, RNARNA y DNA-RNA

Renaturalizacin de dos
cadenas sencillas de
DNA (bases
complementarias)

DNA dplex
desnaturalizado

DESNATURALIZACN
Rotura de los puentes de hidrgeno entre
pares de bases.

Modificacin de las interacciones


hidrofbicas entre bases apiladas.

Genera la prdida de la conformacin


tridimensional o duplohelicoidal,
determinando la separacin de las hebras y
una conformacin al azar o de ovillo.

AGENTES
DESNATURALIZANTES

Temperatura

cidos y
bases

Agentes
qumicos

Temperatura

Es el ms representativo.
Se debilita las fuerzas estabilizadoras de la doble hlice.

cidos y
bases

Valores de pH alejados de la neutralidad (apareaminento)


Condiciones cidas: Ruptura de la estructura primaria
(enlaces y separacin de bases.)
Condiciones alcalinas: desnaturalizacin.

Agentes
qumicos

Molculas polares con grupos amino y carbonilo.


Frecuentes: urea, formamida, formaldehdo.
Compiten en la formacin de enlaces puente de
hidrgeno.

La desnaturalizacin es reversible o irreversible


(recuperacin)

EFECTO DE LA
TEMPERATURA

EFECTO DE CIDOS Y
BASES:

EFECTO DE AGENTES
QUMICOS

INFLUENCIA DE LA DESNATURALIZACIN
SOBRE LAS PROPIEDADES DEL DNA
Viscosidad

PROPIEDADE
S

Absorcin
ultraviolet
a
Rotacin
ptica.
Densidad
de
flotacin.

Permiten diferenciar el DNA de doble hebra y el de hebra


sencilla.

INFLUENCIA SOBRE LA VISCOSIDAD (Rigidez y forma*)

INFLUENCIA SOBRE LA ABSORCIN (dobles enlaces*)

INFLUENCIA SOBRE LA ABSORCIN ULTRAVIOLETA

CURVAS DE DESNATURALIZACIN Y
RENATURALIZACIN

HIBRIDACIN DE
CIDOS NUCLEICOS

INTRODUCCIN
La renaturalizacin depende slo de la complementariedad
de secuencia de las hebras. Lo ms probable es su
reasociacin formando los dplex originales.
Formacin de molculas dplex de DNA cuyas hebras tienen
distinto origen (especie o cido nucleico).
La estabilidad del hbrido depende de la proporcin de bases
complementarias y mayor longitud de las secuencias
apareadas.
La hibridacin puede tener un carcter artificial (homo y
hetero), pero complementario.
La hibridacin relaciona el grado de herencia evolutiva o
conexin (homologa)

PRINCIPIO BSICO
Especificidad de la interaccin entre base
complementarias

Secuencia diana

ELEMENTO
S

Es uno de los fragmentos,


obtenidos por enzimas de
restriccin, de la muestra de DNA.
Sonda
Fragmento corto de DNA, de
secuencia conocida y
complementaria a la secuencia
diana, marcado de forma que
permita su deteccin.

HIBRIDACIN DE CIDOS
NUCLEICOS HOMODUPLEX Y
HETERODUPLEX

FACTORES
Concentracin de cido nucleico.
Nmero de copias de la secuencia diana.
Concentracin y tamao de la sonda.
Temperatura.
Tiempo de hibridacin.
Caractersticas del medio de reaccin.

RIGOR DE LA HIBRIDACIN
DEFINICI
N

CONTROL

Grado de
especificidad en el
apareamiento
conseguido en los
hbridos

Esencial

Capacidad de
reconocimiento
mutuo de dos
secuencias

No alto, que impida


la unin estable de
la sonda a su diana

Apareamiento
completo entre
sonda

No bajo, que
permita la
hibridacin
inespecfica de la
sonda. Falso
positivo

DEPEND
E
Temperatura y
tiempo de
renaturalizacin

Composicin de
bases

Ambiente
qumico:
Presencia de
cationes y
desnaturalizantes
.

MTODOS DE ENSAYOS
DNA CON
SECUENCIA
DIANA

SONDA
MARCADA

MTODOS
En fase
lquida
En
soporte
slido
In situ.

HIBRIDACIN

HIBRIDACIN EN FASE
LQUIDA
Mtodo inicialmente empleado
Muestra de DNA o RNA en
disolucin con la sonda.
Cintica rpida

Tcnica cuantitativa

HIBRIDACIN EN SOPORTE
SLIDO
Ensayo ms simple.
Permite procesar varias muestras
simultneamente.
Cintica lenta.

Fcil control de la hibridacin.

Identifcar en colonias bacterianas el gen en forma de


plsmido recombinante

HIBRIDACIN EN SOPORTE SLIDO:


DOT-BLOT Y SLOT-BLOT
Ensayo ms simple y comn.
Emplea muestras de cido nucleico
sin purificar.
Muestra se aplica gota a gota. Dot
blot.
Muestra en manchas alargadas sobre
un papel filtro. Slot blot

HIBRIDACIN EN SOPORTE
SLIDO: SOUTHERN BLOT
Tcnica simple y fcil.
Detecta fragmentos de DNA (ER)
separados por electroforesis.
Transferencia a un soporte slido o
filtro.
Deteccin

Hibridacin
Transferencia
Desnaturalizacin

Separacin
electrofortic
a

Detecci
n

HIBRIDACIN EN SOPORTE
SLIDO: NORTHERN BLOT
Tcnica simple y fcil.
Detecta fragmentos de RNA
separados por electroforesis.
Transferencia a un soporte slido o
filtro.
Deteccin

TRANSFERENCIA WESTERN
BLOT
No existe hibridacin
Detecta protenas separadas por
electroforesis en SDS-PAGE
Transferencia a un soporte slido o filtro.
Deteccin: anticuerpo marcado o protena
ligante.

MATRICES DE DNA

Biochips

Genochip
s

Genosensor
es

Chips de
DNA

Micromat
rices

BIOCHIPS O MICROARRAYS
Confluencia de la Biologa molecular, la Ingeniera
electrnica y la Informtica

Revoluciona el diagnstico molecular.

Ensayo de hibridacin en soporte slido

Placas de silicio, vidrio u otro material de unos


centmetros de tamao, a cuya superficie se han
adherido segn una disposicin ordenada, conocida,
diversas molculas cortas de DNA.

Se puede hacer un nmero de ensayos muy elevado de


forma simultnea sobre una muestra muy pequea,

TIPO DE MATRICES

Fragmentos de
cidos nucleicos
A partir de muestras
biolgicas o por clonacin.
Se aplican por contacto o
empleando tecnologas
piezoelctricas, trmica o de
electroaerosol.

Oligonucletidos
Colecciones de
oligonucletidos generados
qumicamente in situ (25 60
nt)
Se aplican por anclaje
covalente

MATRICES DE DNA

MATRICES DE EXPRESIN
GNICA

HIBRIDACIN IN SITU

Tisular

Se realiza sobre cortes de tejido (fijados


con formalina, parafina o congelados)
clulas intactas, ncleos aislados.
Deteccin: autorradiografa o
microscopa de fluorescencia.

Cromosmica

Se realiza en preparaciones fijadas en


porta de cromosomas metafsicos.
La secuencia de DNA se trata con
enzimas proteolticas y se desnaturaliza
el DNA.
Hibridacin con la sonda.
Deteccin con sondas marcadas con
fluorforos(FISH).
La detecin se hace bajo un microscopio
de fluorescencia

HIBRIDACIN IN SITU:
TISULAR

Deteccin de virus
patgenos

Diagnstico de
clulas cancerosas

Cambios en la
expresin gentica

Cortes de tejido

Clulas intactas

Ncleos aislados

HIBRIDACIN IN SITU: CROMOSMICA

Diagnstico de
cromosomopata
s

Deteccin de
genes tumorales.

Deteccin de
virus.

Anlisis de
trasplante

PINTADO DE CROMOSOMAS
Chromosome painting
Es llamado cariotipo molecular o pintado de
cromosomas.
Se usa una mezcla de sondas procedentes
de distintas partes de un mismo
cromosoma.
Se consigue fluorescencia a lo largo del
cromosoma completo.

Se facilita la identificacin visual.

Reorganizacin de los
cromosomas en
procesos cancerosos.

Diagnstico de
enfermedades
genticas.

PCR en tiempo real


Permite cuantificar reacciones de amplificacin a medida que ocurren en
tiempo real

Se utilizan termocicladores especializados que utilizan un rayo laser


para scanearlas muestras.

Cada tubo de reaccin contiene una sonda con un colorante que se


une al DNA y emite fluorescencia cuando es iluminado por el lser.

Un detector captura la luz y suministra la informacin a un ordenador

Mtodos

Colorante SYBR
Green

Sondas de
TaqMan

SYBR green TaqMan


Colorante que se une al DNA de
doble cadena
A medida que se copia ms DNA
bicatenario con cada ciclo de
PCR, hay ms copias de DNA
que se unen al SYBR green, lo
que aumenta la cantidad de
fluorescencia emitida.

Son sondas complementarias de


regiones especificas del DNA
diana
Las sondas
colorantes.

contienen

dos

REPORTERO, localizado en el
extremo 5 y puede emitir luz
fluorescente cuando el rayo
lser lo excita.
INHIBIDOR
DE
LA
FLUORESCENCIA:, se une al
extremo 3 de la sonda.
A medida que la Taqpolimerasa
extiende cada cebador separa
el colorante reportero, liberado
del inhibidor, emite luz cuando
es excitado.

SYBR green

TaqMan

Aplicaciones

Anlisis de la expresin gnica.


Determinacin de la carga viral.
Determinacin de organismos
genticamente modificados (OMG).
Genotipificacin

Referencias Bibliogrficas:

LUQUE, J. y HERREZ, A.Biologa


molecular e Ingeniera Gentica.
Ediciones Harcourt. Madrid. Espaa.
2001.

GRACIAS