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C CID
Y
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D LEI
S
A
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N
U
E
N
T
O
PR
Biotecnologa Mdica 2016
Ing. Betty Salazar Pinto
bettysalazar2211@gmail.co
m
OBJETIVO
INTRODUCCIN
ENZIMAS DE
RESTRICCIN
TECNOLOGAS DE
HIBRIDACIN
BIBLIOGRAF
A
INTRODUCCIN
Enzimas de
restriccin
Tecnologas de
hibridacin
cidos
nucleicos
Protenas
NUCLEASAS: DEFINICIN
enzima con capacidad de
escindir los enlaces
fosfodister de la cadena
polinucletida de los cidos
nucleicos. Es una
FOSFODIESTERASA
Escisin en
posicin
terminal o
interna
Endonucleasa
s
Exonucleasas
Tipo de enlace
fosfodister
Tipo de
pentosa y
base
nitrogenada
DNAsas
RNAsas
Tipo a
Tipo b
c
e
p
Es
d
a
id
c
if
NUCLEASAS: CLASIFICACIN
ESCISIN EN POSICIN
ESCISIN EN POSICIONES INTERNAS O
TERMINALES
(5) pApBpCpDpEpFpGpHpIpJpKpL
(3)
Accin de
exonucleas
a 5
Liberan el
nucletido
del extremo
5
Accin de
exonucleas
a 3
Liberan el
nucletido
del extremo
3
Accin de
endonucleasa
Cortan en
una posicin
intermedia
NUCLEASAS:
CLASIFICACIN
ESCISIN SEGN EL
ENLACE FOSFODIESTER
Nucleasa a:
Hidrolizan los enlaces fosfato
formados con el OH 3. Producen
extremos 3-OH y 5- P
Nucleasa b:
Hidrolizan los enlaces fosfato
formados con el OH 5. Producen
extremos 3-P y 5-OH
ESCISIN SEGN EL
NUCLSIDO
pApGpUpGpUpCpGpCpApUpA
pApGpTpGpTpCpGpCpApTpA
ENDONUCLEASAS:
CARACTERSTICAS GENERALES
Se llaman tambin nucleasas de restriccin,
endonucleasas de restriccin, enzimas restrictivas o
restrictasas.
HaeIII (Haemophilusaegytius)
Gran especificidad: sitios de reconocimiento del DNA duplx
e hidrlisis de enlaces fosfodister en cada hebra.
ENZIMAS DE RESTRICCIN:
SISTEMA METILACIN-RESTRICCIN
Un mecanismo de defensa contra la entrada de material
gentico de otro organismo.
ENZIMAS DE RESTRICCIN:
TIPO II
Estructuralmente ms simples(dmero) y ms estudiadas en
Ingeniera Gentica (extremos cohesivos).
Endonucleasa tipo a: 3-OH y 5-P
Sitio de restriccin: reconocimiento e hidrlisis de un mismo
enlace en las dos hebras.
Gran especificidad: sitios de reconocimiento son secuencias
cortas de 4 a 6 pb y palindrmicas.
Los extremos de los fragmentos generados son
idnticos, tienen la misma secuencia (simetra del
palndromoy de la posicin simtrica de los puntos de corte
en cada hebra).
HIBRIDACIN DE CIDOS
NUCLEICOS
INGENIERA
GENTICA
PATOLOGA
MOLECULAR
BIOLOGA
MOLECULAR
Bases
moleculares
Aplicaciones
Mtodos de
ensayo
INTRODUCCIN
La hibridacin se basa en el proceso de renaturalizacin
Renaturalizacin de dos
cadenas sencillas de
DNA (bases
complementarias)
DNA dplex
desnaturalizado
DESNATURALIZACN
Rotura de los puentes de hidrgeno entre
pares de bases.
AGENTES
DESNATURALIZANTES
Temperatura
cidos y
bases
Agentes
qumicos
Temperatura
Es el ms representativo.
Se debilita las fuerzas estabilizadoras de la doble hlice.
cidos y
bases
Agentes
qumicos
EFECTO DE LA
TEMPERATURA
EFECTO DE CIDOS Y
BASES:
EFECTO DE AGENTES
QUMICOS
INFLUENCIA DE LA DESNATURALIZACIN
SOBRE LAS PROPIEDADES DEL DNA
Viscosidad
PROPIEDADE
S
Absorcin
ultraviolet
a
Rotacin
ptica.
Densidad
de
flotacin.
CURVAS DE DESNATURALIZACIN Y
RENATURALIZACIN
HIBRIDACIN DE
CIDOS NUCLEICOS
INTRODUCCIN
La renaturalizacin depende slo de la complementariedad
de secuencia de las hebras. Lo ms probable es su
reasociacin formando los dplex originales.
Formacin de molculas dplex de DNA cuyas hebras tienen
distinto origen (especie o cido nucleico).
La estabilidad del hbrido depende de la proporcin de bases
complementarias y mayor longitud de las secuencias
apareadas.
La hibridacin puede tener un carcter artificial (homo y
hetero), pero complementario.
La hibridacin relaciona el grado de herencia evolutiva o
conexin (homologa)
PRINCIPIO BSICO
Especificidad de la interaccin entre base
complementarias
Secuencia diana
ELEMENTO
S
HIBRIDACIN DE CIDOS
NUCLEICOS HOMODUPLEX Y
HETERODUPLEX
FACTORES
Concentracin de cido nucleico.
Nmero de copias de la secuencia diana.
Concentracin y tamao de la sonda.
Temperatura.
Tiempo de hibridacin.
Caractersticas del medio de reaccin.
RIGOR DE LA HIBRIDACIN
DEFINICI
N
CONTROL
Grado de
especificidad en el
apareamiento
conseguido en los
hbridos
Esencial
Capacidad de
reconocimiento
mutuo de dos
secuencias
Apareamiento
completo entre
sonda
No bajo, que
permita la
hibridacin
inespecfica de la
sonda. Falso
positivo
DEPEND
E
Temperatura y
tiempo de
renaturalizacin
Composicin de
bases
Ambiente
qumico:
Presencia de
cationes y
desnaturalizantes
.
MTODOS DE ENSAYOS
DNA CON
SECUENCIA
DIANA
SONDA
MARCADA
MTODOS
En fase
lquida
En
soporte
slido
In situ.
HIBRIDACIN
HIBRIDACIN EN FASE
LQUIDA
Mtodo inicialmente empleado
Muestra de DNA o RNA en
disolucin con la sonda.
Cintica rpida
Tcnica cuantitativa
HIBRIDACIN EN SOPORTE
SLIDO
Ensayo ms simple.
Permite procesar varias muestras
simultneamente.
Cintica lenta.
HIBRIDACIN EN SOPORTE
SLIDO: SOUTHERN BLOT
Tcnica simple y fcil.
Detecta fragmentos de DNA (ER)
separados por electroforesis.
Transferencia a un soporte slido o
filtro.
Deteccin
Hibridacin
Transferencia
Desnaturalizacin
Separacin
electrofortic
a
Detecci
n
HIBRIDACIN EN SOPORTE
SLIDO: NORTHERN BLOT
Tcnica simple y fcil.
Detecta fragmentos de RNA
separados por electroforesis.
Transferencia a un soporte slido o
filtro.
Deteccin
TRANSFERENCIA WESTERN
BLOT
No existe hibridacin
Detecta protenas separadas por
electroforesis en SDS-PAGE
Transferencia a un soporte slido o filtro.
Deteccin: anticuerpo marcado o protena
ligante.
MATRICES DE DNA
Biochips
Genochip
s
Genosensor
es
Chips de
DNA
Micromat
rices
BIOCHIPS O MICROARRAYS
Confluencia de la Biologa molecular, la Ingeniera
electrnica y la Informtica
TIPO DE MATRICES
Fragmentos de
cidos nucleicos
A partir de muestras
biolgicas o por clonacin.
Se aplican por contacto o
empleando tecnologas
piezoelctricas, trmica o de
electroaerosol.
Oligonucletidos
Colecciones de
oligonucletidos generados
qumicamente in situ (25 60
nt)
Se aplican por anclaje
covalente
MATRICES DE DNA
MATRICES DE EXPRESIN
GNICA
HIBRIDACIN IN SITU
Tisular
Cromosmica
HIBRIDACIN IN SITU:
TISULAR
Deteccin de virus
patgenos
Diagnstico de
clulas cancerosas
Cambios en la
expresin gentica
Cortes de tejido
Clulas intactas
Ncleos aislados
Diagnstico de
cromosomopata
s
Deteccin de
genes tumorales.
Deteccin de
virus.
Anlisis de
trasplante
PINTADO DE CROMOSOMAS
Chromosome painting
Es llamado cariotipo molecular o pintado de
cromosomas.
Se usa una mezcla de sondas procedentes
de distintas partes de un mismo
cromosoma.
Se consigue fluorescencia a lo largo del
cromosoma completo.
Reorganizacin de los
cromosomas en
procesos cancerosos.
Diagnstico de
enfermedades
genticas.
Mtodos
Colorante SYBR
Green
Sondas de
TaqMan
contienen
dos
REPORTERO, localizado en el
extremo 5 y puede emitir luz
fluorescente cuando el rayo
lser lo excita.
INHIBIDOR
DE
LA
FLUORESCENCIA:, se une al
extremo 3 de la sonda.
A medida que la Taqpolimerasa
extiende cada cebador separa
el colorante reportero, liberado
del inhibidor, emite luz cuando
es excitado.
SYBR green
TaqMan
Aplicaciones
Referencias Bibliogrficas:
GRACIAS