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Diagnstico:
Tcnicas Imunolgicas
e Mtodos de Biologia
Molecular
Profa Alessandra XavierPardini
Disciplina: Imunologia Clnica
Introduo:
Resposta Imunolgica Especfica
- mais elaborada
reconhecimento clonagem (multiplicao de
clulas defesa) ativao celular - processo
complexo
- clulas: ly T e B
atacam especificamente o antgeno- resposta
imunolgica de memria
Sistema imune:
- para a proteo e defesa
- problemas podem ocorrer
Problemas/Disfunes
- AUTOIMUNIDADE
- IMUNODEFICINCIAS
- HIPERSENSIBILIDADE
Hipersensibilidade:
- Reao exagerada, alergia = envolve as IgE, histamina, mastcitos
- Diferentes tipos de alergenos
- Cuidados com o paciente, acompanhamento, afastar o alergeno (no
contato)
-
testes cutneos
Autoimunidade:
- A reao ocorre contra o prprio organismo, uma auto agresso,
- Diferentes fatores envolvidos (pr-disposio gentica, reao cruzada
contra o self (prprio), modificao do antgeno; falha na deleo de
antgenos
- Testes: imunofluorescncia indireta (fluorocromos), ELISA (enzimtico)
- Tratamento: imunossupressor, diferentes drogas, exames peridicos
Imunodeficincias:
- Falha da resposta imune, ly T e B (so as mais graves), resposta
inata (menos frequente)
- Diagnstico laboratorial com aplicao de diferentes tcnicas
imunofluorescncia (fluorocromos), ELISA (enzimticos)
- Tratamento: deve-se fazer o acompanhamento do paciente por
exames peridicos, transplante de medula = acompanhamento,
rejeio
- Avaliao constante do paciente para determinao do tratamento
Exemplos: HIV, resposta B, resposta T, resposta B e T (combinada)
Tolerncia Imunolgica:
- Sistema imune torna-se tolerante, independente do estmulo
- Tolerante a um determinado antgeno
Antgenos
- Definio
- Imunogenicidade
- Antigenicidade
- Eptopo
Considerar: reao cruzada, reao inespecfica = aps
ativao Ac de baixa e de alta avidez
Antgenos Naturais
- herdados: eritrocitrios e de Transplante
- Realizar a investigao a fim de se evitar problemas
transfusionais e diminuir a chance de rejeio
Antgenos Naturais
-
ANTICORPOS
Stio de
ligao
do Ag
Ca
de
i
le
pe
sa
d
Fab
Determinante
antignico
(eptopo)
ve
Fc
Molcula de Ac
Regio de
dobradia
Stio de ligao do Ag
smbolo
Anticorpos:
Classe, istipo:
Linfcito B ativado plasmcitos Ig
ANTICORPOS MONOCLONAIS
ANTICORPOS MONOCLONAIS
Imunizao Ativa
So anticorpos pr-formados
(Antgenos preparados)
Soroterapia
- Ac heterlogos cavalos e
coelhos, Ac homlogos seres humanos, Ac
monoclonais
- Primeira forma de terapia
utilizada
Imunidade temporria
NO gera memria
imunolgica
Imunidade duradoura
GERA memria imunolgica
(verificar para cada
vacina/varivel)
DETERMINO DO LIMIAR DE
REATIVIDADE
Introduo
- Os testes sorolgicos ou imunoensaios so tcnicas
para a deteco de antgenos, anticorpos ou
substncias que desempenhem papel de antgenos
- drogas, hormnios, cidos nuclicos
-
Anticorpos monoclonais
Mtodos:
- aperfeioamento, consolidao do que j existe,
tecnologias emergentes, melhora da sensibilidade,
confiabilidade no resultado, execuo mais simples e
adaptveis a automao
- mtodos multiparamtricos: desafio de deteco de
substncias diferentes simunltneamente
TCNICAS COM
REAGENTES MARCADOS
Reagente Marcado
Marcao no modifica interao Ag-Ac
Alto custo
Permite deteco de classes especficas de Ac para um
determinado Ag
Tipo de marcador determina nome do teste
MARCADOR
Radioistopo - RADIOIMUNOENSAIO
Fluorocromo - IMUNOFLUORESCNCIA
Enzima - ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT
Radioimunoensaio
- Primeira tcnica com reagente marcado
- desenvolvido em 1956 deteco de Ac antiinsulina em pacientes tratados com o hormnio
- radioistopos - I125 ou I131 ligao a resduos de
tirosina em protenas
- vantagens: quantitativo, rapidez, preciso, limiar
de deteco em nano ou picogramas
- desvantagens: alto custo do teste, vida mdia
dos reagentes e risco operacional radiostopos
- Uso: Ag e Ac, marcadores tumorais, hormnios
Princpio
quantidade de reagente marcado (radioativo) quantifica o
Ag ou Ac no marcado presente na amostra atravs de
ligao especfica
medida da resposta - contagem radioativa - tipo de
radiao emitida
- radiaes e - contador de cintilao
- radiao - contador gama de cristal slido
Realizado em 3 estgios
Estgio 1 construo da curva de calibrao diluio seriada
do padro
Estgio 2 interpolao dos resultados
Estgio 3 controle de qualidade (amostras com [ ] conhecida)
PEG
carbono
Tipos de Radioimunoensaio
cintiladores
Imunofluorescncia
- Ac + fluorocromos - reatividade especfica com o
Ag
Excitao (nm)
Fluorescena FTIC
495
Texas Red
595
R-ficoeritrina
565
Emisso (nm)
524
620
574
REAGENTES NECESSRIOS
Microscpio de imunofluorescncia
com epiluminao
cmera
Fonte de luz
branca
Fluorescncia
emitida
Filtro de
emisso
Filtro de excitao
Fibra ptica
lmina
Fibra
ptica
IMUNOFLUORESCNCIA
DIRETA
clula
IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA
Conjugado Ac antiimunoglobulina especfico classes
Diluies seriadas ttulo de Ac mxima diluio
onde h fluorescncia
Vantagens: sensvel, especfica, reprodutvel , fcil,
padronizada, mesmo conjugado determina Ac
produzidos em diferentes doenas
Desvantagens: custo do microscpio, subjetividade na
leitura e dificuldade de automao
Uso: deteco de Ac para Treponema pallidum (FTAABS), Toxoplasma gondii, vrus da rubola,
citomegalovrus, vrus herpes simples, Trypanosoma
cruzi, Plasmodium falciparum, auto-Ac.
Antgen
o
Reao
primria
lavage
m
Conjugado Anticorpo
FITC
Reao
secundria
lavage
m
Microscpio de
fluorescncia
CITOMETRIA DE FLUXO
PRINCPIO: anlise individual e simultnea de componentes
celulares atravs da medio do desvio de luz incidente sobre
uma clula e de sinais fluorescentes emitidos pela mesma
Vantagens: permite deteco do tamanho relativo da clula, sua
granulao e de 2 a 7 emisses fluorescentes diferentes em
milhares de clulas por segundo
Desvantagens: alto custo, necessidade de treinamento
Vrios fluorocromos
Uso: imunofenotipagem de linfcitos do sangue perifrico de
pacientes infectados pelo HIV, diagnstico e prognstico de
leucemias, tamanho celular, granulosidade
Tambm chamada de FACS (fluoresecent-activated cell sorter)
Suspenso
de mistura
de clulas
Conjugado
fluorescente
Feixe de laser
Detector
Defletor
Clulas nofluorescentes
Clulas
fluorescentes
Tcnicas imunoenzimticas
- Ac ou Ag marcados com enzimas conjugado ENZIMA
- elevada especificidade
- fcil de ser obtida na forma purificada
- conjugao a Ag e Ac sem interferncias
- produto de reao com substrato fcil de ser
quantificado, mesmo com pequenas quantidades de
enzima
- estvel
- custo acessvel
- vrios tipos fosfatase alcalina, peroxidase
- determina o tipo de substrato
SUBSTRATO CROMOGNICO
- ao serem consumidos por enzimas geram produtos
coloridos solveis (ELISA) ou insolveis (Western
blotting)
- Quantificao do produto espectrofotmetro, cor
visual
ou comparao com padro
- depende do tipo da enzima utilizada
Substrato
Produto
colorido
solvel ou
insolvel
PEROXIDASE
- substrato H2O2 ligado a um cromgeno
- cromgeno com produto solvel - OPD ou TMB
- cromgeno com produto insolvel - DAB ou 4-cloro-1-naftol
FOSFATASE ALCALINA
- cromgeno com produto solvel - NPP
- cromgeno com produto insolvel BCIP ou NBT
enzima
substrato
cromgeno
cor
nm
Peroxidase
H2O2
OPD, TMB
DAB, 4CN
laranja, azul
marrom, violeta
492
P-NFF
5-B-4-C-3-IF
amarelo
lils
450
Fosfatase
alcalina
Ensaio heterogneo
- etapa de lavagem retira reagente marcado no
ligado a fase slida
FASE SLIDA
- conhecido como suporte
- tubos, microplacas, micropartculas ou tiras
- partculas de agarose, poliacrilamida, dextran,
poliestireno
- micropartculas lavagem decantao,
centrifugao, adsoro em fibra de vidro ou captura
- tipos: ELISA, dot ELISA, IMUNNOBLOT
ELISA
- capaz de detectar pequenas concentraes de
Ag e Ac
- reagente ligado a uma enzima
- imobilizao
ploiestireno
em
fase
slida
placa
de
Vantagens:
maior
sensibilidade
e
especificidade, rapidez, baixo custo e adaptao
a diferentes graus de automao
- tipos: direta,
competio
indireta,
de
captura
de
Resultado
visual (qualitativo)
densidade ptica (DO)
(quantificao / espectrofotmetro)
Limiar de reatividade (cut-off)
Titulao (diluio em srie)
Absorbncia
Unidade padro (absorbncia transformada em
unidade)
ELISA indireto
Vantagens: nico conjugado para vrios sistemas
Uso: deteco de Ac de classes determinadas de acordo
com Ag que sensibilizou a placa
Lavadora de
microplacas
Leitora de
microplacas
acoplada a
computador
Western Blotting
identificao de protenas reconhecidas por Ac
separao das protenas - PM - eletroforese em gel
de poliacrilamida
transferncia eletrofortica - nitrocelulose
incubao com amostras - presena
especficos - complexo formado conjugado
de
Ac
Western blotting
preparao do gel (concentrao poliacrilamida/gradiente)
SDS (detergente aninico/confere carga negativa)
migrao: plo - plo +
preparo da amostra (solubilizao das protenas)
tampo corrida
voltagem/amperagem
transferncia (semi-seco; over-night)
membrana (nitrocelulose; PVDF)
Estrutura do DNA
- O material gentico de toda a vida neste planeta formado por apenas
seis componentes.
Acido Desoxirribonucleico (ADN, DNA):
- Contm as instrues genticas
-
Adenina liga-se com Timina (A com T) e Guanina liga-se com Citosina (G com C)
Importante:
-
As instrues codificadas nas sequncias de bases nitrogenadas do DNA constituinte dos genes
so transcritas para molculas de RNA, e destas, traduzidas em sequncias de aminocidos das
protenas.
RNA ribossmico, que constitue, juntamente com certas protenas, minsculos grnulos
citoplasmaticos denominados ribossomos, capazes de unir os aminocidos entre si e formar as
cadeias polipeptdicas que constituem as protenas.
RNA transportador, tm por funo capturar aminocidos livres nas clula, levando-os
at os ribossomos, onde eles se unem para formar a molcula polipeptdica. Cada RNAt
apresenta, em uma determinada regio de sua molcula, uma trinca de bases denominada
anticdon. O aminocido transportado por um RNAt depende do seu anticdon. Por exemplo,
molculas de RNAt com anticdon AAA ou AAG transportam sempre o aminocido fenilalanina;
os RNAt com anticdons CCA, CCG, CCU ou CCC transportam somente glicina.
RNA mensageiro, so cpias dos genes codificadores de protenas e contm, em sua
sequncia de bases nitrogenadas, as instrues sobre a ordem em que os aminocidos devem
ser unidos para produzir determinado polipeptdeo.
Histrico
- 1983- Kary Mullis- Prmio Nobel de Qumica em 1993.
- DNA polimerase - ocorre naturalmente em
organismos
vivos, onde tem a funo de duplicar o DNA durante a
diviso celular. A polimerase se liga a um DNA fita
simples
riando uma fita de DNA complementar.
- Na poca ainda no havia sido descoberta uma DNA
polimerase termoestvel. Processo inicial de Mullis era
ineficiente, necessitava de muito tempo, ateno
constante e grandes quantidades de DNA polimerase.
- O processo foi melhorado
PCR (Reao em
Cadeia da
Polimerase)
uma tcnica que
amplifica uma
sequncia especfica
de DNA, como
objetivo de torn-la
abundante e
disponvel para
diversas tcnicas de
biologia molecular.
tcnica in vitro
replicao do DNA
Alternncia de temperatura
Tcnica
1. Desnaturao:
94C 96C
Separa a dupla fita do template
em duas fitas simples
2. Pareamento:
37C 65C
Primers ligam-se em locais
especficos do DNA molde
3. Extenso:
72C
DNA polimerase usa os dNTPs
adicionando-os a nova fita de
acordo com a regra de
pareamento polimerizao.
Atualmente,
NAT Tcnica de cido Nuclico
- Bio-Manguinhos: para a rede pblica de sade como tambm
o prprio Ministrio da Sade (MS)
-KIT NAT HIV/HCV
-Nome
CLONAGEM
A clonagem a imitao perfeita de um mecanismo de
reproduo assexuada ato multiplicador realizado por
organismos unicelulares ou portadores de poucas
clulas, sensveis a qualquer mudana no meio
ambiente.
Este mtodo reprodutor gera seres geneticamente
idnticos matriz utilizada.
Um clone uma
cpia exata de uma
planta ou animal,
com todas as
caractersticas do
original, inclusive os
defeitos.
CLONAGEM
1. DNA molde
para amplificao
tamanho da molcula
2. Escolha da vetor
replicao
transcrio
expresso
Plasmdeo, fago
PROTENAS E PEPTDEOS
RECOMBINANTES
O processo de obteno destas substncias to rgido
quanto qualquer outra molcula medicamentosa. Alm
dos bioensaios para verificar sua atividade biolgica, so
tambm verificados seus padres de qualidade fsicoqumicos e microbiolgicos garantindo segurana,
eficcia e estabilidade.
Em relao aos efeitos txicos, h uma grande
preocupao em averiguar se estas biomolculas
possuem aes imunotxicas, j que podem ser
reconhecidas pelo sistema imunolgico como invasores.
Terapia Gnica
A possibilidade de substituir genes ausentes
ou defeituosos, por outra cpia normal dentro
de uma clula somtica do organismo,
demonstra uma manobra fantstica no
sentido de eliminar as doenas humanas.
Porm a maior limitao desta tcnica ainda est vinculada
ao vetor que entrega o gene teraputico.
O atual objetivo das indstrias farmacuticas a procura
por novos vetores, principalmente no virais.
Alguns aspectos do ponto de vista farmacutico como:
biodisponibilidade, formas e formulaes farmacuticas
ideais, classificao teraputica, farmacocintica e
farmacodinmica, ainda so questes que nem sequer
foram mencionadas de forma concreta.
Agradecimentos
Profa Adelaide Vaz pelo material gentilmente cedido
Bibliografia
Pesquisa na internet (maio 2011)
ABBAS A. K et all., Imunologia Bsica Funes e
Distrbios do Sistema Imune, ed revinter, 2003.
CALICH V & VAZ C., Imunologia, ed Revinter, 2001.
Pesquisa na internet em novembro 2012
Pesquisa na internet em novembro 2013