TEMA

Integrantes:

-Lpez Caceres,Carmen
-Rodas Salazar, Miguel
-Chipa Aybar ,Eliana
-Cienfuegos Adrianzen,Erika
-Salaverry Acedo, Silvia
-Pea Ramos, Evelyn
-Moran Quiroz, Vernica

Ciclo:

Seccin:
IX

- 2F

Asignatura:

- Biologa Molecular

Docente:

- MsC.Q.F. Minaya Galarreta, Angelica

 Extraccin:

sacar los componentes desde un

compartimento celular. Involucra:
Lisis

de las clulas que contienen a los AN

Inactivacin de nucleasas
Clarificacin: separacin de los AN de los restos celulares.

Purificacin:
De

Separacin de AN:

protenas solubles
De otros AN no deseados
De Lpidos, carbohidratos
De sales y otros compuestos orgnicos

 Los cidos nucleicos almacenan la

informacin gentica de los organismos
vivos y son los responsables de la
transmisin hereditaria.
Gran parte del desarrollo fsico de un
organismo a lo largo de su vida.
Las protenas que elaboraran sus
clulas y las funciones que realizaran
estn todas registradas en esta cinta
molecular.
Existen dos tipos: el ADN y el ARN.

Es una macromolcula muy larga , filamentosa

y formada por desoxirribonucletidos, cada uno
de ellos compuesto por una base nitrogenada,
un azcar desoxirribosa y un grupo fosfato.

El ARN tiene una sola

hebra.
La
pentosa
de
los
nucletidos constituyentes
es ribosa.
Sus cuatro bases son: A,
G, C, U.
Es lamolculaque dirige
las etapas intermedias de la
sntesis proteica.

ARNr: Recibe la informacin gentica. Traduce las

protenas. Se ubica en el ribosoma, organela donde
se sintetiza las protenas.

Mtodos de fragmentacin y lisis celular

para la extraccin de AN
El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza
necesaria para romper el material de inicio (clulas o
tejido) y la delicadeza requerida para preservar las
molculas de inters (ADN o ARN).
Mtodos fsicos
Homogenizacin mecnica,
Homogenizacin en solucin
Molienda manual en mortero
Bolitas de vidrio
Sonicacin

Mtodos enzimticos
Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murmico y N-acetil
glucosamina de peptidoglicn de la pared celular de bacterias
Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras
Proteasas: rompe enlaces peptdicos de prot. de pared y
membrana plasmtica e interacciones clula-clula.

Mtodos qumicos
Detergentes

LISIS CELULAR

2. Clarificacin. Eliminacin de restos

celulares
(debris)
Centrifugation

Filtracin
Mtodo mixto: enzimas + centrifugacin

3. Purificacin
Por qu purificar?
Nucleasas que se liberan al lisar las clulas degradan los cidos nucleicos.
Tcnicas:
Desproteinizacin con fenol, que al desnaturar protenas causa su
precipitacin.
Precipitacin de protenas con sales (salting out)

Se usa principalmente para

extraccin de ADN plasmdico
de E. coli.

Fundamento del mtodo:

Se basa en las diferencias en la
desnaturalizacin, renaturalizacin
del ADN plasmdico y el ADN
cromosmico al aplicar NaOH en
presencia de un detergente
fuertemente aninico como el
Dodesilsulfato de Sodio (SDS) y
Acetato de potasio.

ADN plasmidico-pequeos circulos cerrados covalentemente

ADN cromosmico-fragmentado

- Elaborado por Murray y

Thompson en 1980.
- Adecuado para extraer y purificar
ADN
de
vegetales
y
especialmente
indicado
para
eliminar los polisacridos y los
compuestos poli fenlicos que
daaran al ADN.

- Tcnica usada para la Mini preparacin de

ADN plasmdico .
- Requiere de cultivo bacterial a gran
escala.
- Separa ADN plasmdico superenrrollado
del ADN plasmdico circular que est en
estado relajado, concentrndolos por
centrifugacin en una gradiente de
Bromuro de Etidio Cloruro de Cesio (BrEt
CsCl.)

Superenrrola
do:
Covalentement
e cerrado y
muy empacado.

DNA
circular.
DNA que no
se ha
empacado.

En clulas eucariticas, el
mARN difiere de otras especies
de ARN, en que contiene en su
extremo 3, en una extensin
relativamente grande de 200 a
300 residuos de adenina, en
una secuencia conocidacomo
poli A+.

La cromatografa en columnas
es usada normalmente para la
purificacin
de
grandes
cantidades de ARN Poli (A).

CROMATOGRAFIA DE
AFINIDAD
Permite separar el conjunto
de los mRNA celulares de
otros
acidos
nucleicos,
merced a la hibridacin que
va a producirse entre sus
colas de poli A( en el
extremo 3) y los oligmeros
que contiene la resina
cromatogrfica.

 Logra una purificacin

rpida
y
eficiente
comparada con los
mtodos
convencionales.
Los sistemas de fase
slida absorbern los
cidos nucleicos en el
proceso de extraccin
dependiendo del pH y
contenido de sales
buffer.

PRINCIPIOS
La interaccin de los
puentes de hidrgeno con
una matriz hidroflica bajo
condiciones caotrpicas.
Intercambio inico bajo
condiciones acuosas por
medio de un intercambio
aninico.
Y mecanismo de exclusin
por afinidad y tamao.

 La purificacin en fase slida es normalmente

efectuada por el uso de una columna giratoria operada
bajo fuerzas centrfugas.
TIPOS:
Partculas de vidrio
Tierra de diatomeas
Matrices de slice
Transportadores de intercambio aninico
PASOS DE FASE SLIDA
Lisis celular, adsorcin de cidos nucleicos, lavado y
elucin

 El principio est basado en la elevada

afinidad de las cadenas de ADN cargadas
negativamente con respecto a las
partculas
de
slicas
cargadas
positivamente.

 El sodio juega un rol como un catin enlazante o

puente que atrae el oxgeno cargado negativamente
en los fosfatos de las cadenas de cidos nucleicos.

 PARTCULAS DE
VIDRIO
Gel de agarosa
involucrado en el uso de
sales caotrpicas
facilitan el enlazamiento
de ADN a vidrio comn
de slice.
La absorcin de cido
nucleico es el sustrato
de vidrio , ocurre debido
al mecanismo y principio
similar al de la adsorcin
de cromatografa de
adsorcin.

TIERRA DE
DIATOMEAS
Es una roca
sedimentaria silcea
formada por micro fsiles
de diatomeas, algas
marinas unicelulares que
secretan un esqueleto
sliceo llamado frstula

 Quitan el ADN trenzada doble pero

no el ARN o las protenas.
La diatomita resultante enlazada con el ADN es
luego lavado con un tampn que contiene alcohol.
Este es luego dejado de lado y el ADN es eludo en
un tampn bajo en sal o en agua destilada.

La separacin es una
forma simple y eficiente,
el cual es utilizado
actualmente
en
la
purificacin de cidos
nucleicos.
Usualmente, portadores
magnticos con ligandos
afinos
inmviles
o
preparados
con
biopolmero que muestra
afinidad al cido nucleico
a tratar son usados en el
proceso de aislamiento.

Uso de perlas magnticas implica cuya

superficie tiene una carga que se puede
cambiar basndose en el pH.
A pH bajo estn cargndose
positivamente, atrayendo a las molculas
de ADN con carga negativa y permitiendo
que las protenas y los contaminantes se
eliminen mediante el lavado

Purificacin de cidos
nucleicos en base a
micro esferas
magnticas

El cido nucleico es
luego eluido de las
partculas magnticas
con un tampn de
elucin

Macromolculas mas abundantes:

Presentan gran variedad: Cantidad
Tamao
Funcin
La clave de su variedad: Los aminocidos.

Aislar una protena:

Una clula: Gran variedad de protenas.
Esencial para determinar sus
propiedades y actividad.
Mtodos de separacin:
Tamao, carga, propiedades de unin .

 DESCRIPCIN:
Separa las protenas basndose en la carga elctrica de su
superficie inica, usando resinas que son modificadas por grupos
qumicos cargados positivamente o negativamente.

FASES:
Fase estacionaria o intercambiador inico:
Carga elctrica fija.
Retienen iones mviles.
Fase mvil:
Solucin acuosa: Solventes orgnicos.
Contienen especies inicas.

FUNDAMENTO:
Las molculas cargadas de la muestra:
intercambiadores inicos.
Las molculas pueden asociadas o disociadas
(unin reversible).
Intercambiadores: aninicos y catinicos.

INTERCAMBIADORES ANINICOS:
Portadores grupos con carga positiva.
Unen aniones de forma reversible.
Grupos amino alifticos o aromticos.
INTERCAMBIADOR CATINICO:
Portadores de grupos con carga negativa.
Unen cationes de forma reversible.
SO3, grupo carbonilo, hidroxilo fenlico.

DESCRIPCIN Y FUNDAMENTO:

Llamada tambin cromatografa de exclusin

molecular.
Separa en funcin de su tamao molecular de la
protena.
Matriz: sephadex G-150. cuando este material es
humectado se transforma en gel.

MTODO Y MATERIAL:
Columna cilndrica
Geles utilizados:
sephadex
poliacrilamida
agarosa
Fase estacionaria:
Grnulos de material esponjoso.

 La matriz esta formado

por un polmero
entrecruzado con poros
de tamao determinado.
Las protenas de mayor
tamao migran ms
rpido hacia la parte
inferior.
Las de menor tamao
penetran en los poros y
su marcha es mas lenta.

La Cromatografa de Afinidad
permite la separacin de mezclas
proteicas por su afinidad o
capacidad
de
unin
a
un
determinado ligando.

Las protenas que tienen una alta

afinidad hacia su grupo qumico
especfico tales como los ligandos,
se unirn covalentemente y estas
se unirn a la matriz de la columna,
mientras las otra pasarn a travs
de la columna.

Qiagen - BioRobot EZ1 Advanced