CINTICA

ENZIMTICA

Reacciones anablicas y catablicas

Las reacciones donde sustancias simples se unen

para formar sustancias ms complejas se llaman
reacciones anablicas.

Sntesis de protenas

Insulina

Reacciones endergnicas y exergnicas

Una reaccin endergnica es una reaccin qumica

que necesita o utiliza energa.

Fotosntesis.

Una reaccin que libera energa se conoce como una

reaccin exergnica.

Respiracin celular.

Energa de activacin

Muchas reacciones exergnicas

necesitan calor (energa) para
comenzar.
Esta energa se conoce como
energa de activacin.
La

cantidad de energa de activacin

es, generalmente, mucho menor que la
energa que libera la reaccin.

Enzimas

Hacen
posibles
las
reacciones, disminuyendo
la cantidad de energa de
activacin que se necesita.
Controlan la velocidad a la
que ocurre la reaccin.
Permiten que las reacciones
ocurran a unas temperaturas
que no hagan dao al
organismo.

Con organismos

Con cambios en el m.o

CATABOLISMO DE LOS POLIHIDROXIALCANOATOS EN LA BACTERIA DEPREDADORA

"BDELLOVIBRIO BACTERIOVORUS": APLIACIONES BIOTECNOLGICAS Y DISEO DE NUEVOS
SISTEMAS PARA LA EXTRACCIN DEBIOPLSTICO EN CULTIVOS BACTERIANOS

Virginia Martnez Lpez 2012

La produccin de enzimas microbianas a

nivel industrial se lleva a cabo por 2
mtodos:
a) Fermentacin en superficie (mtodo
Koji):
solo
para
obtener
enzimas
extracelulares

b) Cultivo sumergido: se lleva a cabo en

grandes fermentadores o biorreactores que
controlan perfectamente las condiciones de
cultivo

Extraccin de enzimas
Si la enzima es extracelular, no hay
que romper ninguna membrana.
Si es intracelular hay que romper la
membrana externa y a veces tambien
la interna. Para estos dos ltimos
casos existen diferentes mtodos de
rotura celular tanto qumicos (con
disolventes orgnicos, detergente,
choque
osmtico)
como
fsicos
(sonicacin, cizalla lquida o slida,
congelacin y descongelacin)

 Una vez extrada la enzima, esta se asla,

es decir se eliminan todos los cidos
nucleicos que han sido liberados al medio
tras la rotura celular, y partculas slidas
como fragmentos de membrana y clulas
parcialmente rotas. Despus se concentra
y enriquece y por ltimo se purifica.

Torta
Celular

ENZIMA
EXTRACELULAR

ENZIMA
INTRACELULAR

Fermentacin

Fermentacin

Separacin
Slido - lquido

Separacin
Slido - lquido

Concentracin

Rompimiento Celular
(Extraccin)

A purificacin
o formulacin

Separacin
Slido lquido
Concentracin
A purificacin
o formulacin

Fig. Produccin de Enzimas

Caldo
Gastado

Torta
Celular

Estructuras Principales de Enzimas

Lactasa
Origen: Levaduras y
fngico

Accin: hidrlisis Lactosa

Lipasa
Origen: Fngico
Accin: Hidrlisis de
triglicridos

Invertasa
Origen: Levaduras y fngico
Accin: Hidrlisis de
Sacarosa

Detergentes biolgicos

n ms importante de las enzimas hidrolticas

Pectinasas
Produccin de zumo de frutas
Al prensar fruta y vegetales para la
obtencin de jugo, las pectinas de
alto peso molecular reducen la
produccin.
Pectinasas procedentes de cultivos
sumergidos de Aspergillus y
Rhizopus.
Se pica la fruta y se aaden
pectinasas para degradar las
pectinas de larga cadena.
Se reduce la viscosidad del zumo,
facilitando la filtracin y se obtiene
ms cantidad.
Alimentacin de bebs, las
pectinasas maceran las fruta y los
vegetales para hacerlos ms
suaves y fciles de comer.

Amilasas
Hornear pan
El uso de enzimas en
panadera se ha vuelto
popular.
Las amilasas aceleran la
degradacin del almidn, y
as aumenta el contenido de
azcar en la masa,
acelerando el proceso de
fermentacin.
El volumen del pan
preparado con enzimas
aumenta.

Actividad enzimtica:

a = (e)
S

P
P

[ S,P ]

S
t

dP
a = Vt 0 =
dt

_ dS
=
dt
0

t 0

Medicin experimental a:
Rango de linealidad: permite determinar a que [enzima ] se
produce una Rx lineal.
t usuales: 10 30/
Emplear un blanco o testigo
Mtodo Analtico: Espectrofotometra

a: Unidades de actividad
Unidad

Internacional (U.I.): Cantidad E que cataliza la

transformacin de 1 mol de S por min. en
Condiciones Ambientales Definidas. [S], pHopt ,
Topt

Cintica Enzimtica:
Principales Variables: e, S, P, I, A
[ pH, T ]
Principio Fundamental:

(e)

Diseo y Evaluacin de un proceso enzimtico:

Expresin matemtica para la cintica de
la reaccin catalizada.

Factores que afectan la velocidad de

una reaccin enzimtica
Concentracin de Enzima

Concentracin de sustrato

Catlisis en FASE HOMOGNEA:

( a ) Hiptesis equilibrio rpido ( Michaelis Menten

Modelo Cintico de
Michaelis - Menten

La derivacin de la ecuacin se basa en:

1) que la concentracin de S es mayor que
la concentracin de E
2) La concentracin de Producto al inicio de
la reaccin es insignificante
3) el paso limitante de la velocidad es la
transfoemacin de ES a E+P

En equilibrio rpido:

En estado estacionario:

En equilibrio rpido:
Ks= K2 = [E] [S]
K1
[ ES]

[ES ] = [E][S]/Ks

Si vo=k3 [ES]

Vo = k3 [ES]
[E]t [E]+ [ES

Si k3 [E]t = Vmax

Vo =
Vmax

Vo =
Vmax

Vo

[E][S]/Ks
[E]+ [E][S]/Ks

[ES]
[E]+ [ES]

[S]/Ks
Vmax
1 + [S]/Ks

s
s

En estado estacionario:
K1 [E] [S] = k2 [ES] + K3 [ES]

Si vo=k3 [ES]

Si k3 [E]t = Vmax

[ES] =K1 [E] [S]

(k2 + K3 )
Vo = k3 [ES]
[E]t [E]+ [ES

Vo =
Vmax

Vo = K1 [E][S]/(k2 + K3 )
Vmax [E]+ K1 [E][S]/(k2 + K3 )

[ES]
[E]+ [ES]
Vo =
Vmax

[S]/Km
1 + [S]/Km

Estado estacionario: La concentracion del com

Mantiene constante en el tiempo

Ecuacin de la velocidad de una reaccin enzimtica

Por qu determinar Km?

Km es una medida de la afinidad de la enzima
por el sustrato cuando k3<k2. Km=(k 2+k3)/k1
Km establece un valor aprox. para el valor
intracelular de sustrato
Km es constante para una enzima dada, permite
comparar enzimas de diferentes organismos o
tejidos o entre distintas protenas
Un cambio en el valor de Km es un modo de
regular la enzima

Catlisis en FASE HOMOGNEA:

( a ) Hiptesis equilibrio rpido ( Michaelis Menten )
( b ) Hiptesis del estado estacionario ( Briggs Haldane )
E+S

K1
K2

ES

K3

E+P
P

[ ]
V.S
v=
K+S
V = K3 . e

dc
=0
dt

S
t

Inhibicin reversible o Enzimticos:

a)

Inh. Competitiva (P1):

b)

Inh. No Competitiva (P2):

c)

Inh. Mixta o Combinada

P 1 + P2

KAp = K ( 1 + P )
K1

V
VAp =
1+P
K2

Inh. Anticompetitiva
V =

VAp . S
KAp + S

VAp y/o KAp

( I )

Ecuacin generalizada para generar

cualquier modelo cintico sobre un sustrato,
considerando:
S
P1 + P 2

S: Sustrato inhibidor
P1: producto, inhibidor competitivo
P2: producto, inhibidor no
competitivo

v
s

k s
k Kp

kes 1

IV
k K k K 2 K

1
s
Kp
s
1
p

K 1 Kp

IV
K K 2 K
K

K1 K 2 K1 K2

v AP s
v
K AP s
v AP
V: velocidad

y/o K AP : f(i)

Reacciones enzimticas reversibles: S

.
k

E S k1 ,k 2 E S 3 ,k 4 E P
VS VP P

K
KP
V
S
P

1
K KP

k 2 k3
k 2 k3
K
; KP
; V k3 e; VP k 2 e
k1
k4

Determinacin Grfica de Parmetros Cinticos:

Eje Y

Eje X

Intercepto
Eje Y

Intercepto
Eje X

Pendiente

Lineweaver Burk

1/v

1/s

1/VAp

- 1/KAp

KAp/VAp

Hanes

s/v

KAp/VAp

- KAp

1/VAp

Eadie Hofstee

v/s

VAp

VAp/KAp

- KAp

(1/t) . ln(si/s)

(si/s)/t

VAp/KAp

KAp

- 1/KAp

Mtodo

Integrado

Determinacin experimental de Parmetros cinticos:

1
v

1
V

1
K

1
S

V, K

Efecto de Parmetros Ambientales

aW

pH
T: ejerce dos efectos contrapuestos a

1 K = K0 exp (-Ea / RT);

Ea: 4 - 20 Kcal

2 KD = KD0 exp (-Eia/ RT);

mol
Eia: 40 - 200 Kcal
mol

KD: constante de inactivacin

trmica enzima.
Eia: representa la energa de
activacin del proceso de
inactivacin enzimtica.
K: (V/e) constante cataltica,
reactividad del complejo ES.
Ea: energa de activacin.

Actividad de Agua
El agua es el solvente en donde ocurren las reacciones
qumicas y enzimticas de la clula.
La actividad de agua (aW) del medio representa la fraccin
molar de las molculas de agua totales que estn
disponibles, y es igual a relacin que existe entre la
presin de vapor de la solucin respecto a la del agua pura
(p/po).
Variaciones en la actividad de agua puede afectar la tasa
de crecimiento, la composicin celular y la actividad
metablica de la bacteria, debido a que si no disponen de
suficiente cantidad de agua libre (no asociada a solutos,
etc) en el medio necesitaran realizar ms trabajo para
obtenerla y disminuir el rendimiento del crecimiento.

T pt: para un proceso enzimtico

depende del tiempo de operacin.

Para Diseo y Evaluacin del

comportamiento de reactores
enzimticos:
Modelo:

de

KD e
dt

Efecto del pH del medio

El sitio activo de la enzima
esta
frecuentemente
compuesto
de
grupos
ionizables que deben estar en la forma inica
adecuada para mantener la conformacin,
unir los sustratos o catalizar la reaccin.
La actividad de la enzima debe ser medida al
pH ptimo

Cintica de Fase Heterognea

Enzima inmovilizada : aquella que est fsicamente
localizada en una regin definida del espacio,
manteniendo su actividad cataltica y pudiendo ser
usada repetida y continuamente.
Las ventajas del proceso:
a) aumento de la estabilidad
b) reutilizacin de los componentes
c) la enzima no permanece en la solucin al finalizar
el tratamiento y
d) diseo de reactores adaptables para cada enzima
inmovilizada, permitiendo un reciclado de producto
que aumente su pureza.

Enzimas Inmovilizadas:
Enzima asociada o contenida en una matriz
Aumento de estabilidad funcional

Facilidad de recuperacin
Desarrollo de procesos continuos

Eficiencia de uso

Flexibilidad operacional

Control de reaccin

Pureza del producto

Costo fabricacin

Cintica de Fase Heterognea

Enzimas Inmovilizadas
Mtodo

Proceso
inmovilizaci
n

Prdida Estabilidad Costo

activida biocatalizad elaboracin
d
or

Adsorcin

Simple

baja

baja

bajo

Enlace
covalente

complejo

alta

alta

alto

Entrecruzamient intermedio
o

moderad intermedia
a

moderado

Cristalizacin

complejo

alta

Muy alto

Inclusin en gel

intermedio

moderad baja
a

variable

Retencin en
membrana

intermedio

moderad variable
a

alto

muy alta

Enzimas Inmovilizadas
- adsorcin
Unin
- covalente

Contencin

Agregacin

- inclusin en geles
- retencin en membranas
- CLEC
- CLEA

CLEA LentikatsR

Enzimas Inmovilizadas

Propiedades deseables en una

matriz
Alta rea especfica.
Alta capacidad de carga.
Elevada resistencia mecnica,
qumica y biolgica, insolubilidad,

Enzimas Inmovilizadas

En general: Deseable disponer

de

matrices

de

estructura

macroporosa, con suficiente

resistencia

mecnica

evitar

disgregacin

la

para
o

fractura durante la operacin

del bioreactor.

Enzimas Inmovilizadas

Limitaciones para uso industrial:

Mayores costos de elaboracin del
biocatalizador.
Moderado
rendimiento
expresin a.

en

la

Para el procesamiento de S de alto

peso molecular.
Resistencia
cambio.

de

la

industria

al

Enzimas Inmovilizadas

Limitaciones

de

menor

relevancia para aplicaciones de

enzimas inmobilizadas:
En anlisis (Biosensores)
Medicina.

Evaluacin del proceso de

inmovilizacin:
Capacidad

del soporte a ligar la

enzima, Rendimiento
de
EI
EI
RI (RI)

Inmovilizacin
ET EI ER EP
Expresin

aficiente de la a,
Actividad Especfica (AE)
EI
AE
M

La calidad del catalizador

enzimtico producido vinculada a su
estabilidad operacional expresada
a travs del t1/2
Para

el caso de una cintica de

inactivacin simple de primer orden:
ln 2
t1/ 2
KD

Efectos de la Inmovilizacin de
enzimas
Afectan su comportamiento cintico
Efectos conformacionales

1)

Relacionados con la alteracin de la

estructura de la molcula enzimtica.
Difciles de evaluar y modelar.

Efectos Microambientales

2)

Efectos de particin.
Restricciones difusionales.