Controle Microbiolgico de

Produtos Farmacuticos e
Cosmticos No Estreis
QUESTES DE PROVAS;
CONTEDO DAS PRXIMAS AULAS;
HORRIO DE ATENDIMENTO ON-LINE;
blog do professor:
http://chicoteixeira.wordpress.com

Aspectos Gerais
Em condies ordinrias de uso tero contato com reas portadoras de flora
Produtos
no estreis so aqueles nos quais se
microbiana natural, constituda de saprfitas em nmero por vezes elevado;
admite
conceitualmente a presena de carga
A ateno no controle dos produtos no estreis assegura que a carga
microbiana,
tendo
emou vista
as
microbiana presenteembora
no produto,limitada,
seja no aspecto
qualitativo
quantitativo,
no comprometa a sua qualidade final ou a segurana do paciente;
caractersticas
de sua utilizao;

Produtos cosmticos

De administrao oral ou tpica

Aspectos Gerais
O objetivo imediato comprovar a ausncia de
microrganismos patognicos e determinar o
nmero de microrganismos viveis, em funo
dos tipos de utilizao do produto;

Padres Microbianos
As primeiras incluses de limites microbianos
aplicados a produtos farmacuticos e seus
insumos ocorreram de forma vaga, como a
recomendao de ausncia de emboloramento;
11 e 12 edies da USP:
1936 e 1942, respectivamente;
No formulrio Nacional de 1970 e na 18 Edio
da Farmacopia, do mesmo ano, a expresso foi
modificada para:

Padres Microbianos
Drogas vegetais e animais devero estar, o
mximo possvel, isentas de microrganismos,
sendo que os patognicos no devero estar
presentes;
interessante lembrar que o primeiro insumo
farmacutico com especificao relativa
qualidade microbiolgica foi a gelatina, na USP XII
de 1942, com o limite tolerado, em funo de sua
origem, de 104 bactrias totais por grama;
Esta especificao foi alterada diversas vezes,
tendo passado por 5x103/g, na 18 Edio; 104/g,
na edio seguinte e, finalmente, 103/g a partir da
20 Edio;

Padres Microbianos
Alm dessa exigncia quantitativa havia outro
requisito, isto , ausncia de patgenos
especficos numa determinada tomada de ensaio,
sendo que este aspecto foi se tornando mais
exigente;
Com a tomada de ensaios de:
10 mg ou menos USP XII;

ALTERADA PARA

10 mg USP XVI;
10 g ou menos USP XVIII;

ALTERADA PARA

Padres Microbianos
Em relao aos fitoterpicos, a Portaria n 123 de
19 de outubro de 1994, na Norma Tcnica para
Registro de Fitoterpicos, estabelece a seguinte
especificao para matrias-primas vegetais:
Menos que 105/g de total de viveis;
Menos que 104/g de leveduras ou fungos;
Menos que 103/g de enterobactrias;
Ausncia de Salmonella sp., P. aeruginosa,
S.
aureus, E. coli e fungos da famlia Aspergillus;

Padres Microbianos
Apesar do reconhecimento, h muitos anos, da
importncia do controle microbiano de produtos
no estreis, a implantao e aceitao dos
padres sanitrios tem ocorrido lentamente;
Produtos cosmticos

Quanto aos produtos cosmticos, a CTFA

(Cosmetic Toiletry and Fragrance Assoc.)
adotou limites de tolerncia que se
tornaram referncia internacional. Estes
limites
so
no
mais
que
500
microrganismos por grama em produtos
para bebs e naqueles utilizados na rea
dos olhos e de no mais que 1000
microrganismos por grama para todos os
outros, alm de mencionar que nenhum
produto deve ter contedo microbiano
considerado nocivo para o usurio;

Mtodos de Anlise
Envolvem tanto os medicamentos no estreis
quanto os cosmticos, abrangem trs etapas
fundamentais:

transporte e preparao
da coleta;
amostra
Amostragem
englobando
para anlise;

Mtodos de Anlise
Determinao numrica ou contagem das formas
viveis;

Mtodos de Anlise
Isolamento e identificao dos microrganismos
indesejveis a serem pesquisados;

Amostragem
A amostragem a ser efetuada para investigao
quanto ao atendimento aos padres microbianos
deve ser:
Em termos de abrangncia do volume contido, do nmero
de unidades contenedoras, e das operaes unitrias
envolvendo risco de contaminao adicional ou
proliferao microbiana;
Representativa
Em se tratando de sacos ou barricas contendo matria-prima no estril na
forma pulverizada, dispositivos de amostragem devem permitir a obteno de
fraes da parte inferior, mediana e superior de cada um de (raiz de N ou raiz
de N + 1) do nmero total dos recipientes;

Amostragem
Nos processos contnuos, a segmentao como
incio, meio e fim do processo deve estar
contemplada na amostragem;
Considerando o produto terminado, toma-se via
de regra duplicata ou triplicata da amostra,
representando incio, meio e fim do processo de
enchimento, admitindo que aps o fechamento
do material de acondicionamento a introduo de
contaminantes no mais existir;
O transporte deve ser em condies adequadas
de temperatura;

Amostragem
Quantidade a ser analisada:
A recomendao das principais farmacopias,
para enriquecimento na pesquisa de patognicos
, geralmente, de 10 g(mL), alm da contagem
total em igual quantidade;
No caso do volume total da amostra ser de
10 g(mL), ou inferior, este total deve ser
analisado. A tomada de ensaio pode ser reduzida
para 1 g(mL) em amostras de produtos de alto
valor agregado;

Amostragem
Preparao da amostra:
A primeira preocupao ao preparar a amostra consiste
na verificao da atividade antimicrobiana do produto
devido presena de conservantes na frmula;
Estes devem ser inativados com substncias adequadas,
conforme sua natureza qumica;

Amostragem
Preparao da amostra:
A adio dos inativantes, previamente esterilizados por
algum dos processos eficientes, deve ser previamente
validada;
Outro cuidado importante,
para
no
impedir
o
crescimento microbiano,
o ajuste do pH do
produto diludo para a
faixa da neutralidade;

Amostragem
Preparao da amostra:
A homogeneizao da amostra fundamental no sentido
de conduzir a transferncia para etapas subsequentes de
forma representativa, ainda que a mesma tenha sido
diluda por exemplo em soluo salina peptonada (0,1 %),
soluo tamponada (pH 7,0) ou caldo lactose;
Algumas formas farmacuticas ou cosmticas podero
exigir tratamento especfico, no sentido de permitir o
contato ntimo da amostra com o meio diluente:
Assim, no caso de produtos em aerossol, em que a
tomada de amostra pode considerar o peso da
embalagem antes e aps expelir alquotas do produto e
propelente, este ser naturalmente eliminado;

Amostragem
Preparao da amostra:
Forma de manuseio operacional trabalhosa o sabonete,
que exige fragmentao criteriosa, seguida de leve
aquecimento, recurso tambm aplicvel no caso de
supositrios e pomadas;
Produtos com fase oleosa exigem a adio de agente
tensoativo, cuja concentrao deve ser cuidadosamente
definida para evitar efeito inibidor sobre possveis
microrganismos contaminantes;
Agente tensoativo

Mtodos de Contagem de
Microrganismos
Em meio slido, com semeadura da amostra

em profundidade (Pour Plate);

Em meio slido, com semeadura da amostra

em superfcie;
Membrana filtrante;
Nmero mais provvel;

Mtodos de Contagem de
Microrganismos
Pour Plate:
Consiste na transferncia de alquota de 1 a 2 mL da
diluio da amostra (de cada diluio a ser considerada)
para rplicas de placas de Petri estreis (usualmente de 2
a 3 a cada diluio);
O meio de cultura estril fundido e resfriado a 45 48C,
em quantidade de cerca de 20 mL, vertido sobre cada
uma das placas contendo amostra, realizamos ento a
homogeneizao com movimentos em S ou 8 sobre a
bancada de trabalho, as quais permanecem at
solidificao a temperatura ambiente;

Mtodos de Contagem de
Microrganismos
Pour Plate:

Segue-se incubao das

placas, em estufa, na
posio invertida;

Aps 2 a 5 dias de
incubao a 30 35C,
para bactrias e 5 a 7 dias
para bolores e leveduras, a
20 25C, as colnias so
contadas;

Mtodos de Contagem de
Microrganismos
Pour Plate:
Para contagem total de bactrias os meios oficialmente
recomendados so principalmente gar casena-soja e
gar nutriente;
Para fungos, gar Sabouraud-dextrose e gar batata;

Mtodos de Contagem de
Microrganismos
Semeadura da amostra em superfcie:
O meio de cultura preparado e distribudo previamente
em placas de Petri. Empregando-se pipetas estreis,
volumes de 0,1 a 0,5 mL de cada diluio considerada so
distribudos na superfcie do gel j solidificado, sendo o
espalhamento efetuado com movimentos cuidadosos ou
com o auxlio de basto de vidro ou ala de Drigalski;
A escolha do meio de cultura,
condies de incubao e
Na dependncia da densidade da amostra,
clculos para determinao
daabsoro
carga contaminante
haver
total pelo meio. Asvivel
placas
invertidas
so ento
equivalem ao descrito para
a tcnica
Pourincubadas;
Plate;

Mtodos de Contagem de
Microrganismos
Membrana filtrante:
Alquotas do produto sob forma lquida ou suas diluies
so filtradas atravs de membranas apropriadas (0,45 m
ou 0,20 m de poro e 47 mm de dimetro, constitudas em
derivados celulsicos), seguindo-se a deposio das
membranas, na mesma posio, sobre placas contendo
meio de cultura;
O clculo para
contaminantes
anteriormente;

Esta metodologia vantajosa por permitir

volumes
elevadostotal
na amostragem
e pela
determinar
o nmero
de
acuidade, apresentando recomendao
viveis
igualparaaoamostras
descrito
especial
contendo agentes
antimicrobianos;

Mtodos de Contagem de
Microrganismos
Nmero mais provvel (NMP):
A determinao do NMP de microrganismos se baseia em
estimativa fundamentada em probabilidade. Assim, indica
o valor dentro de uma faixa que reflete o nmero de
microrganismos presente;
Embora apresentando impreciso maior que os outros
mtodos descritos, ainda recomendado e muito
empregado, inclusive como mtodo oficial, no controle
microbiolgico de medicamentos, cosmticos, alimentos
e guas;

Mtodos de Contagem de
Microrganismos
Nmero mais provvel (NMP):
Uma vantagem de seu emprego consiste em permitir
melhor revitalizao dos microrganismos debilitados, em
funo do perfeito contato da amostra com o meio de
cultura, enquanto o uso do meio slido fundido seria fator
adicional de estresse, uma vez que a temperatura do
meio, no momento da homogeneizao da amostra no
seria favorvel a esses contaminantes;
Embora permita avaliao de amostras com nveis elevados de
contaminao, sua indicao para situaes nas quais se espera
valores baixos de contagem;

Mtodos de Contagem de
Microrganismos
Nmero mais provvel (NMP):
A metodologia emprega meios lquidos, usando-se
diluies seriadas das amostras inoculadas nos mesmos.
Exige a disponibilidade de tabelas estatsticas especficas
para obteno de resultados a partir das leituras;
O nmero de rplicas empregadas a cada diluio pode
variar, sendo mais comuns tabelas construdas a partir de
3 ou 5 rplicas. No clculo de contaminantes da amostra
deve ser considerado ainda o fator de diluio utilizado;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Procedimentos:
Os procedimentos bsicos sofrem pequenas distines
entre os compndios oficiais de diferentes pases,
entretanto os aspectos bsicos so mantidos;

Meios de Enriquecimento:
As tomadas de ensaio recomendadas so da ordem de
10 g(mL), quantidade que pode ser simultaneamente
usada para promover o enriquecimento no seletivo;
Para pesquisa de E. coli e Salmonella sp., em 100 mL de
caldo lactose e para pesquisa de Staphylococcus aureus
e Pseudomonas aeruginosa, 100 mL de casena-soja;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Enriquecimento:
A incubao deve ser a 36 1C, durante 24 a 48 horas;
Para Salmonella sp., procede-se tambm ao
enriquecimento seletivo, tomando-se volumes de 10 mL
da suspenso resultante do enriquecimento no seletivo,
para os caldos tetrationato e selenito-cistina, em volumes
de 100 mL, ento incubados em estufa, durante 24 horas
a 36 1C;

Meios de Diferenciao:
Aps enriquecimento, alquotas so transferidas, por
repique, no geral por estria ou por picada, para meios de
cultura para isolamento e de diferenciao;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Espalhamento nos
quatro quadrantes

gar
semi-slido
para
Repique
por picada
provas
de motilidade
com movimento
em S

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Staphylococcus aureus;
gar Baird-Parker (colnias pretas, halo transparente):
De uso especfico para estafilococos coagulase-positivos, este meio
contm cloreto de ltio e telurito em concentraes que inibem a flora
acompanhante;
Simultaneamente, o piruvato e a glicina estimulam seletivamente o
crescimento de estafilococos;
Devido presena de gema de ovo no meio de cultura, as colnias de
estafilococos apresentam halos transparentes originados por liplise
ou protelise; o meio de cultura opaco devido lecitina.
Adicionalmente, originada a colorao negra devido reduo do
telurito;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Staphylococcus aureus;
gar Vogel-Johnson (colnias pretas, halo amarelo):
Trata-se de meio adequado para a investigao de estafilococos
manitol-positivos. Considerando a capacidade de reduo do telurito
e a fermentao do manitol deste grupo de microrganimos;
A concentrao elevada de manitol e a adio de vermelho de fenol
como indicador de pH facilitam a visualizao desta caracterstica;
Os estafilococos em geral apresentam-se tolerantes frente a
concentraes elevadas de sais como cloreto de sdio e cloreto de
ltio. Este gar devido presena de cloreto de ltio, inibe o
crescimento de microrganismos indesejveis. A produo de cido a
partir de manitol responsvel pelo halo amarelo caracterstico;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Staphylococcus aureus;
gar Manitol (colnias amarelas, halo amarelo):
Caracteriza-se por formulao adequada para a
investigao de estafilococos. Devido elevada
concentrao salina impede o crescimento da maioria das
outras bactrias, exceto alguns microrganismos halfilos.
A degradao do manitol a cido comprovada pela
viragem do indicador de pH vermelho de fenol;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Pseudomonas aeruginosa;
gar Cetrimida (colnias esverdeadas, com fluorescncia):
Emprega
brometo
de
sal
de
amnio
quaternrio
de
gar
Pseudomonas
para
Piocianina
cetiltrimetilamonio (cetrimida) como agente seletivo, com notvel
(colnias
esverdeadas,
com fluorescncia
poder
inibitrio
sobre microrganismos
distintos azul):
de Pseudomonas
aeruginosa;
Valoriza a deteco do pigmento piocianina, reconhecido pela
gar Pseudomonas
para Fluorescena
Tanto
a formao
fluorescncia
azul; do pigmento verde piocianina como o aspecto
(colnias claras
e amarelas,
com fluorescncia
fluorescente
das colnias
luz ultravioleta
ocorrem nesteamarela):
meio;
Tambm de composio semelhante, porm facilitando a visualizao
da fluorescncia amarelo-esverdeada;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Escherichia coli;
gar Mac Conkey (colnias vermelho-tijolo a prpura,
com halo de precipitao de bile):
Consiste em meio seletivo para o isolamento de Salmonelas e
bactrias coliformes, caracterstica decorrente de seus componentes
sais biliares e cristal violeta, que inibem a flora Gram (+);
A lactose, tambm presente na composio, tem sua degradao
evidenciada devido presena do indicador de pH vermelho neutro;
As colnias lactose-negativas so incolores (Salmonella sp.) e as
lactose-positivas so vermelho-violeta com halo turvo, devido
diminuio do valor de pH e a precipitao dos cidos biliares
(Escherichia coli), ou rosadas e mucides (Enterobacter, Klebsiella);

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Escherichia coli;
gar Eosina-Azul de Metileno (EMB) (colnias vermelhoescuras, brilho metlico):
Usualmente empregado na identificao de Escherichia coli, este
meio de cultura apresenta contedo rico em corantes, que inibe os
microrganismos Gram (+);
Enquanto colnias de Enterobacter aerogenes se apresentam com
centro cinzento, aquelas de Escherichia coli, graas sua interao
com a eosina e o azul de metileno, apresentam colnias tpicas com
brilho metlico esverdeado e centro escuro, inconfundveis;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Escherichia coli;
gar Endo
(colnias rosadas a vermelhas, brilho metlico):
Meio de cultura para identificao de coliformes fecais, devido ao seu
contedo de sulfito sdico e fuccina reprime consideravelmente o
crescimento de bactrias Gram (+);
Os coliformes que degradam a lactose produzem aldedo e cido. O
aldedo, por sua vez, libera fuccina a partir da combinao fuccinasulfito, conferindo s colnias a colorao vermelha. No caso de
Escherichia coli esta reao apresenta tal intensidade que promove a
cristalizao da fuccina, o que resulta em colorao das colnias
com brilho metlico estvel, com reflexos verdes;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Salmonella sp.;
MEIOS DE ENRIQUECIMENTO SELETIVO Caldo Selenito-Cistina e
Caldo Tetrationato;
MEIOS DE ISOLAMENTO gar Verde Brilhante (colorao
transparente) e gar Sulfito de Bismuto (colnia preta ou
esverdeada);
O efeito seletivo destes meios de cultura baseia-se no seu contedo
de verde brilhante, inibindo a flora Gram (+) acompanhante. O efeito
diferenciador deve-se ao fato de as colnias de microrganismos
fortemente redutores apresentarem uma elevada presso de eltrons
Portanto,
no centro
colnias
ocorre reduo a sulfeto de ferro,
na parte central,
quedestas
diminui
na periferia;
ocorrendo a colorao negra. Ao redor, apenas possvel a reduo
dos ons bismuto a bismuto metlico, acarretando o surgimento de
brilho metlico na periferia da colnia;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Salmonella sp.;
gar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) (coln. Vermelhas,
ncleo negro):
Devido sua composio, e particularmente graas ao contedo
reduzido de desoxicolato, adequado para demonstrar a presena de
Salmonella e Shigella;
A degradao dos aucares xilose, lactose e sacarose da sua
composio a cido promove a viragem do indicador de pH vermelho
de fenol a amarelo, indicativo de outras bactrias;
O tiossulfato serve como substncia de reao e o sal de Ferro (III)
como indicador da formao de sulfeto de hidrognio, visualizado
ento nas colnias negras de sulfeto de ferro;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Salmonella sp.;
gar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) (coln. Vermelhas,
ncleo negro):
As bactrias que descarboxilam lisina cadaverina so reconhecidas
por promoverem a colorao prpura ao redor das colnias, devido
elevao do valor de pH;
Vrias destas reaes podem ocorrer simultnea e sucessivamente,
permitindo originar matizes de colorao;
Tambm, incubaes prolongadas podem promover inverses de
viragem do indicador de pH, podendo ser inclusive devido
evaporao dos cidos formados;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Salmonella sp.;
gar Trplice Aucar-Ferro (colorao avermelhada na
superfcie, amarela no fundo, precipitao de sulfeto de
ferro):
Possibilita a investigao de Proteus, Hafnia, Providencia e outras
bactrias que no fermentam a lactose ou o fazem muito lentamente,
mas que fermentam a sacarose de maneira relativamente rpida;
A degradao de acar com formao de cido pode ser
comprovada pelo indicador vermelho de fenol, que passa para a
colorao amarela, e a alcalinizao decorre em cor vermelho-escura
(Salmonella sp.). O tiossulfato sofre reduo a sulfeto de hidrognio
por alguns microrganismos, o que por reao com sal frrico produz
sulfeto de ferro, de cor negra;

Pesquisa de Patognicos Especficos

Meios de Diferenciao:
Salmonella sp.;
gar Trplice Aucar-Ferro (colorao avermelhada na
superfcie, amarela no fundo, precipitao de sulfeto de
ferro):
O volume de meio de cultura dispensado no tubo e a sua
solidificao so de forma a permitir que haja, no mesmo,
uma poro inclinada para repique por estria superficial,
e uma coluna na parte inferior para repique por picada,
em profundidade;

Provas Adicionais
Havendo suspeita de presena destes microrganismos, e
coerncia com a caracterstica micromorfolgica, deve
ser seguida a pesquisa empregando outras provas
bioqumicas e sorolgicas especficas conforme se faa
necessrio;
Capacidade de fermentao de diferentes acares;
Potencial de aproveitamento de sais amoniacais como
nica fonte de nitrognio e de citrato como nica fonte de
carbono (gar citrato);
Formao de acetona (reao positiva de VogesProskauer), reao de peroxidase, coagulase e outros;

OBRIGADO