BIOLOGA MOLECULAR

MTODOS DE TRANSFERENCIA
DE GENES EN PLANTAS

Integrantes: Valeria Flores.

Cristina Guevara.
Gabriel Navarrete.
Christian Prez.
Ana Tello.
Semestre: Octavo.
Fecha: 05 de Julio del 2016.

Produccin de
animales
transgnicos
ADN
es
microinyectado
en
proncleos de clulas
embrionarias despus
de la fertilizacin.
Esto es debido a la
disponibilidad
de
tecnologa
especializada
en
fertilizacin in vitro, que
permite
manipulacin
del vulo, cigoto o
embrin prematuro.

Produccin de
plantas
transgnicas
Protoplastos
o
meristemos
que
pueden ser cultivados
y
utilizados
para
regeneracin
de
plantas enteras.
Son utilizados para la
transferencia
de
genes seguido por
regeneracin.

Tambin se utilizan
polen o cigotos para
la transferencia de
genes en plantas.

Clulas diana para transformacin

El primer paso en la tecnologa de transferencia de genes es seleccionar
clulas que sean capaces de dar lugar a plantas completas transformadas.

Tipo de clula diana

Cultivos
celulares
o
protoplastos
Clulas meristematicas de
embrin
inmaduro
u
rgano
Clulas
en
embriones
inmaduros,
brote
y
meristemos florales
Polen

Mtodo utilizado para la regeneracin

Organognesis o embriognesis va fase de
callo
Regeneracin de plantas in vitro a partir de
clulas transformadas
Desarrollo normal (in vivo) de embrin,
brote o flor seguido por el uso de polen
(transformado) de la planta quimrica para
producir semillas transformadas.
Polen utilizado para polinizacin que
conduce a la produccin de plantas

Transferencia
de genes en
polen
Puede dar lugar
a
gametos
genticamente
transformados,
que si se utilizan
para
la
fertilizacin (in
vivo) puede dar
lugar a plantas
enteras
transformadas.

Insercin de
ADN en el
cigoto
(in vivo o in
vitro), seguido
por
la
liberacin
de
embriones,
pueden
tambin
ser
utilizados para
producir
plantas
transgnicas.

Enfoque
alternativo
Es el uso de
clulas
individuales en
embriones
o
meristemos,
que pueden ser
cultivadas
in
vitro
para
la
produccin
de
plantas
transgnicas.

Vectores para transferencia de genes

Caractersticas generales
La mayora de
vectores
llevan
marcadores
genticos,
que
permiten
el
reconocimiento de
clulas
transformadas
(otras
clulas
mueren debido a
la accin de un
antibitico
o
herbicida) y se
describen
como
marcadores
de
seleccin.

Entre
los
marcadores
genticos,
el
ms comn es el
nptII,
proporcionando
resistencia a la
kanamicina.

Otras
caractersticas
incluyen:
(I)
nico sitio de
restriccin
mltiple;
(II)
orgenes
de
replicacin
bacterianos (por
ejemplo, ColEI).

Vectores basados en plsmidos Ti y

Ri de Agrobacterium
Mecanismo de induccin de
tumores de la bacteria del
suelo
Agrobacterium
tumefaciens,
que
es
el
organismo causal de la
enfermedad
corona
de
agallas.

Una especie relacionada A.

rhizogenes
causa
la
enfermedad
races
en
cabellera.

Esta enfermedad es causada

debido a la transferencia de un
segmento de ADN de la bacteria
al genoma nuclear de la planta.
El segmento se llama T-ADN y es
parte de un plsmido grande Ti
(inductor
de
tumores)
encontrado en cepas virulentas
de Agrobacterium tumefaciens.

Megaplasmido Ri (inductor de
raz) se encuentra en cepas
virulentas de A. rhizogenes.

Regin A
Regin B

Comprende
el
T-ADN Responsabl
(ADN
e
de
la
transferido) replicacin
responsable
de
la
induccin
de tumores

Regin C
Regin D

Responsabl
e
de
la Responsabl
conjugacin e
de
la
virulencia.
Esta regin
se
llama
regin
de
virulencia
(vir)

COMPONENTES DEL
Proceso
de
infeccin:A.
PLSMIDO
TI
tumefaciensintroduce en la clula
vegetal una parte de su ADN (ADN de
transferencia) el cual es integrado
dentro del genoma de la planta.
Los genes del ADN-T. Expresados
en su hospedero e inducen la
formacin de tumores, la sntesis de
unos derivados de aminocidos
llamados opinas (como octopina o
nopalina)
y
de
sntesis
de
fitohormonas.
El ADN-T esta localizado en el
plsmido Ti que adems contiene los
genesvirque son necesarios para la
transferencia e incorporacin del
fragmento de ADN en el genoma de
la planta.

PONENTES DEL PLSMIDO TI

Plsmidos Ti presentan dos

regiones esenciales para la
movilizacin e integracin del TDNA en las clulas vegetales.

La
otra
es
la
llamada
reginVirque se requiere para
que la escisin, transferencia e
integracin
del
T-DNA
sean
efectivas

Una
corresponde
a
ambos extremos del TDNA
(LB:
borde
izquierdo y RB: borde
derecho) que consisten
en
una
repeticin
directa casi perfecta de
25 pb (5'TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC3')

PONENTES DEL PLSMIDO TI

ONENTES DEL PLSMIDO TI

La regin vir
Aproximadamente 35 Kbp
La separacin fsica de T-ADN
Mientras las secuencias de
y la regin vir en dos
borde
funcionan
en
plsmidos diferentes no
orientacin cis con respecto a
afecta a la transferencia de TT-ADN, la regin es capaz de
ADN siempre y cuando estn
funcionar en la orientacin
presentes en la misma Clula
trans.
de Agrobacterium.
Esta organizado en 6
operones
Genes vir A,B D y G son
necesarios
para
la
virB, virC, virD, virE
virulencia.
=Policistrnico
Genes vir C y E son
virA, vir G
necesarios
para
la
formacin de tumores .

ONENTES DEL PLSMIDO TI

Vir A y Vir G reaccionan con la
presencia de exudados de plantas
heridas y promueven la activacin
se
encuentra
en
la
transicional de los genes vir.VirA
membrana interna de las clulas
de Agrobacterium y es un
quimiorreceptor de compuestos
fenlicos producidos por las
La protena citoplasmtica VirG
plantas como la
es fosforilada por VirA que pasa
a su forma activa y estimula la
transcripcin del resto de genes
vir.

acetosiringona

Los productos resultantes de la activacin del gen virD;

VirD1 (topoisomerasa) y VirD2 (endonucleasa), realizan
dos cortes en la cadena de DNA en la zona comprendida
entre los bordes del T-DNA.
Tras el corte, VirD2 permanece covalentemente unida
al extremo 5 de la hebra de DNA impidiendo la
deleccin de este extremo y que este extremo sea el
primero en entrar en el ncleo de la clula vegetal.
El DNA de simple cadena que se libera se recubre por
protenas VIRE2, que protegen al DNA de la degradacin
por nucleasas a la vez que lo dirigen hacia el genoma de
la clula vegetal.
En el transporte a travs de la membrana bacteriana
estn implicados los productos del opern virB.
El T-DNA es convertido a su forma bicatenaria y la parte
monocatenaria en el plsmido Ti es reparado por
sistemas celulares.

Diseo De Vectores
Plsmidos
Ti Y Ri
Los
plsmidos Ti no

permiten su uso
directo debi a:
Su gran tamao
La ausencia de
sitios nicos de
enzimas de
restriccin
La propiedad de
induccin de
tumores.

Las clulas tumorales no

pueden desarrollarse en
brotes normales.
El
desarme
de
los
plsmidos
Ti se logro
mediante la sustitucin de
tumor inducido de genes
en
T-ADN
por
los
marcadores seleccionables
tales
como
nptll
que
proporciona
recistencia
contra antibiticos como la
kanamicina.

Elementos esenciales
para el diseo de
vectores
de
transformacin:
T-ADN (desarmado)
Genes vir

Dos tipos de vectores

Agrobacterium

Vectores co-integrados
Vectores Binarios

Vectores co-integrados
Estos vectores son construidos por la
recombinacin entre un plsmido Ti
desarmado que contiene el borde
izquierdo y un pequeo vector que
contiene el gen de inters flanqueado
por el borde derecho y una regin
homloga al borde izquierdo. La
recombinacin se lleva a cabo por un
evento
de
entrecruzamiento
de

Uno de los co-integrados

primeros vectores
Vectores
cointegrative,
pGV3850
fue
desarrollado a partir de
un
plsmido Ti tipo nopalina (C58),
donde casi todo el ADN-T ha sido
borrada
y
reemplazada
por
pBR322, un vector de clonacin
comn pequea de E. coli.
El vector intermedio (por ejemplo
PGV 1103) basado en pBR322 se
conjuga en pGV3850 en la regin
de pBR322 homologa. D
espus
de
cointegracin,
pGV3850:: 1103 T-ADN contiene la
totalidad de vector intermedio que
incluye el DNA no deseado, que
tambin se transfiere al husped
de la planta junto con el gen
destinado a ser transferido

Vectores co-integrados

VECTORES BINARIOS
Basado en que el
gen VIR

VECTOR pBin 19

localizado en un plsmido
"ayudante" Ti que tiene el
conjunto de T-DNA eliminado

-Diseado en 1984
-Popular an en la
actualidad
-Basado en una amplia
gama de huspedes
vector pRK252

T-DNA

Est en un vector separado

(vector binario) diseado para
replicare tanto en E. coli y
Agrobacterium
y
capaz
de
realizar transferencia entre estas
dos especies

-Gen de resistencia a kanamicina (APH-1)

para la seleccin en bacterias
-Lmites de T-ADN derivado de pTiT37
-Plantacin marcador de transformacin
seleccionable CNNT-U aislado del transposn
-TNS (Este marcador se asocia con el
promotor y seal de poliadenilacin
derivada del gen de la sntesis de la
nopalina o nos)
-Sitio de clonacin mltiple deriva de PUCL 9
y alojado dentro de la regin lacZ (~ gen
galactosidasa)

VECTORES DE VIRUS

Genomas
aislados son
capaces de
infectar el tejido
vegetal intacta

Empleados
como
vectores
de
transformacin
de
plantas
Genomas viral no
pueden INTEGRARE
con el genoma de la
planta
Usan
solamente
para un estudio de
la
expresin
de
transferencia
de
genes transitorios
Vectores de virus no
se pueden utilizar
para la produccin
de
plantas
transformadas
de
forma
estable
(plantas

TRANSFORMACIN MEDIANTE
AGROBACTERIUM

Dicotiledn
eas
-

Monocotiled
neas

Usado para
la
transferenc
ia de ADN
extrao en
angiosperm
as

Utiliza sus
plsmidos
como
vectores

REQUISITOS PARA LA
PRODUCCIN DE
(i) Los explantes
de plantas deben producir compuestos
PLANTAS
TRANSGNICAS
activos con el fin de inducir los genes vir para la
virulencia

(ii) Las agrobacterias inducidas deben tener acceso

a las clulas que son competentes para
transformacin; para que se produzca la
transferencia de genes, las clulas deben replicar su
ADN o bien realizar mitosis
(iii) Los tejidos o explantes transformadas a menudo no
se regeneran, y es difcil de combinar competencia
transformacin con totipotencia

LOS EXPLANTES USADOS PARA LA TRANSFORMACION

Protoplastos

Clulas
cultivadas
en
suspensi
n

Cortes de
tejido

Secciones
de
rganos
enteros

Epidermis

Heridas e
inoculaci
n de
plantas
enteras

Clulas de callo
(no
diferenciadas y
proembriognic
as),

LOS GENES MARCADORES DE SELECCIN

Y PUNTUACIN DE LAS CLULAS
TRANSFORMADAS / CALLOS O BROTES
Explantes inoculados
con Agrobacterium

Ejemplo: tabaco
emplea
El antibitico
kanamicina

Portan del vector

requisito que tiene el
gen de inters

Permiten que las clulas

transformadas puedan
sobrevivir en medios
que contienen niveles
txicos del agente de
seleccin, que suele ser
un antibitico o un
herbicida.

Seleccionan las clulas /

tejidos transformados

Genes marcadores
seleccionables
disponibles en el vector

GEN DE NEOMICINA FOSFOTRANSFERASA (NPTII).

Se usa tambin
para detectar su
presencia en el
tejido
transformado
o
planos
transgnicos.

Gen de la enzima
NPT II se utiliza a
menudo con el
promotor nos

Imparte
resistencia a la
kanamicina

Gen
se
utiliza
como
marcador
legibles
en
experimentos que
implican
la
transferencia de
genes
que
conducen a la
produccin
de
aviones
transgnicos.

GEN DE NEOMICINA FOSFOTRANSFERASA

(NPTII).
Se utiliza tanto como un marcador de seleccinen los
experimentos que implican la transferencia de genes que
conducen a la produccin de plantas transgnicas.
Imparte resistencia a la kanamicina
En algunos casos, el gen nptII tena efectos adversos sobre la
expresin del gen introducido deseable de manera que otros
medios de mejorar su expresin tuvieron que ser utilizados.

Para un ensayo enzimtico de NPT II, la enzima a partir de plantas

transgnicas se fracciona primero usando electroforesis en gel no
desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE).
Puesto que la enzima desintoxica kanamicina por fosforilacin, ATP
marcado radiactivamente (32P) se usa con kanamicina en una capa
de agar, que se utiliza para cubrir el gel que contiene la enzima.
Todo el conjunto se incuba al 35C dando lugar a la incorporacin
de 32P en la kanamicina pueden ser detectados por
autorradiografa.

la captacin directa
de ADN por protoplastos puede ser
estimulada por productos qumicos como el polietilen glicol
(PEG). El cal se usa tambin para estimular la captacin de
liposomas y mejorar la eficiencia de la electroporacin
PEG en una concentracin elevada ( 15-25 % ) se precipitar
macromolculas inicas como el ADN y estimular su absorcin
por endocitosis
Sin embargo , existen graves problemas en el uso de este
mtodo para obtener plantas transgnicas debido a los
problemas de regeneracin de plantas a partir de protoplastos

GEN CLORANFENICOL
ACETIL TRANSFERASA
Este gen se utiliza principalmente como un gen reportero
(CAT)
El primer gen aislado de E. coli cofifica para una enzima cat la cual

est ausente en los mamferos y plantas superiores, de modo que

cada vez transferido en una construccin gnica, su presencia
puede ser detectada mediante un ensayo de enzima.
La enzima usa acetil CoA + cloranfenicol (32P) como sustratos y
ayuda en la transferencia de un grupo acetilo hacia el cloranfenicol.
La presencia de acetil chloramfenicol se detecta como una banda
separada mediante autorradiografa.

GLUCURONIDASA (GUS)
GEN (GUS).
La enzima glucoronidasa , popularmente descrita como GUS,
descompone glucurnidos que dan una reaccin de color , por
lo que su presencia se puede detectar in situ , es decir en el
interior del tejido de la planta .
Varios glucurnidos , que pueden utilizarse como sustratos ,
incluyen
p - nitro fenilo glucurnido ( PNPG ),
3 - indol glucurnido ( BCJG ),
glucurnido resorufina ( REG ) .
La enzima GUS es codificada por un gen gus ,aislada por
primera vez de E. coli . La principal ventaja de utilizar este
gen reportero radica en su ensayo , que no requiere la
extraccin de ADN , electroforesis o autorradiografa .

GEN DE LUCIFERASA
(LUX).

En presencia de un sustrato adecuado, la enzima luciferasa

confiere al organismo la capacidad de brillar en la oscuridad.
Se diferencia en bacterias y lucirnagas. Mientras que en las
bacterias, consta de dos subunidades peptdicas codificadas por
genes lux A lux B y, en lucirnaga consiste en un nico
polipptido codificado por un gen lux.
La enzima luciferasa en estos dos sistemas utiliza diferentes
sustratos para la luminiscencia.
Cuando la fuente del gen es una bacteria, el sustrato utilizado es
un aldehdo (decanal), que se suministra exgenamente.
Alternativamente, cuando la fuente es lucirnaga, luciferina (un

Transferencia mediada de ADN (DMGT)

La transferencia de genes mediada por Agrobacterium ha sido el
mtodo ms comnmente usado de la transferencia de genes en las
plantas, pero en el pasado, los cereales que comprenden los cultivos
alimentarios ms importantes, no eran susceptibles de este mtodo de
transferencia de genes (transferencia de genes mediada por
Agrobacterium) Adems, en muchos cultivos, incluyendo cereales y
legumbres, las tcnicas de cultivo de tejidos para la regeneracin no
tuvieron mucho xito. Estas dos limitaciones oblig a la intensa
bsqueda de mtodos alternativos para la transferencia de genes.
La entrega fsica de ADN o transferencia de ADN mediada (DMGT),
como se describe a menudo, emplea mtodos, que pueden agruparse
de acuerdo con el tipo de clula diana. Por ejemplo, estimulada
qumicamente , la endocitosis de plsmidos o liposomas cargadas con
ADN y la electroporacin se emplean para la administracin de ADN a

MICROINYECCIN, MACROINYECCIN Y TIRO

CON MICROPROYECTILES
Entre otras tcnicas se tiene la microinyeccin, macroinyeccin y tiro
con microproyectiles.
Se pueden utilizar con una variedad (por ejemplo,
embriones
inmaduros, meristemas de rganos, gametos, cigotos, etc.).
Estas tcnicas alcanzaron significacin en el pasado, debido a la
regeneracin de plantas transformadas a partir de tejidos derivados de
protoplastos fue difcil en muchas especies particularmente en los
cereales
Sin embargo, estos mtodos ya no se consideran importantes, ya que
la transferencia mediada por Agrobacterium por ahora se ha hecho
posible en amplio espectro de especies de plantas.

CAPTACIN DE ADN POR PROTOPLASTOS

ESTIMULADA QUMICAMENTE
la captacin de ADN directa por protoplastos puede ser estimulada
por productos qumicos como el polietilen glicol (PEG).
PEG tambin se usa para estimular la captacin de liposomas y
para mejorar la eficiencia de la electroporacin
En una concentracin elevada ( 15-25 % ) puede
precipitar
macromolculas inicas como el ADN y estimular su absorcin por
endocitosis sin ningn dao del protoplasma, seguido de la
formacin de la pared celular y la iniciacin de la divisin celular.
Estas clulas pueden ahora ser sembradas en placas a baja
densidad en medio de seleccin . Sin embargo , existen graves
problemas en el uso de este mtodo para obtener plantas
transgnicas debido a los problemas de regeneracin de plantas a
partir de protoplastos

LA MICROINYECCIN DE
ADN
La regeneracin de plantas a partir de protoplastos
transformados , todava sigue siendo un problema . Por lo tanto
tejidos cultivados , que fomentan el desarrollo continuo de las
estructuras inmaduras , proporcionan dianas celulares alternativos
para la transformacin.
Estas estructuras inmaduras pueden
incluir embriones inmaduros , meristemos , polen inmaduro , polen
en germinacin , vulos aisladas, clulas cultivadas en suspensin
embriognicos , etc.
La principal desventaja de esta tcnica es la produccin de plantas
quimricas con slo una parte de la planta transformada
Sin embargo , a partir de esta planta quimrica , plantas
transformadas de origen unicelular se pueden obtener
posteriormente .

Cuando se utilizan clulas o protoplastos como objetivos en la

tcnica de microinjecrion , se utilizan micropipetas de vidrio
con punta de dimetro 0,5 10 m para la transferencia de
macromolculas en el citoplasma o el ncleo de una clula
receptora o protoplasto .
Las clulas receptoras se inmovilizan sobre un soporte slido
o unido artificialmente a un sustrato o en poder de una pipeta
bajo succin.
A menudo se emplea un micromanipulador especialmente
diseado para la microinyeccin de ADN . Aunque , esta
tcnica proporciona una alta tasa de xito, el proceso es lento
, caro y requiere de personal altamente calificado y

MICROPROYECTILES
(PISTOLA
DE
PARTCULAS) PARA LA TRANSFERENCIA
GNICA
En los ltimos aos, se ha demostrado que la administracin de ADN a
clulas de la planta tambin es posible, cuando micropartculas
pesadas (de tungsteno u oro) recubiertos con el ADN de inters se
aceleran a una velocidad muy alta inicial (1400 pies por segundo).
Estos microproyectiles, normalmente 1-3m de dimetro, son llevadas
por un 'Macroproyectil' o 'bala' y se aceleran en clulas de plantas
(clulas diana que pueden ser de polen, clulas cultivadas, las clulas
en los tejidos y meristemas diferenciados), de modo que puedan
penetrar las paredes celulares de tejido intacto.
La aceleracin se consigue, ya sea por una carga explosiva (explosin
de la plvora) o mediante el uso de ondas de choque producida por
una descarga elctrica de alto voltaje.

Las ventajas de este mtodo incluyen :

miles de partculas son aceleradas al mismo tiempo , causando
mltiples golpes que resultan en la transferencia de genes en
muchas clulas simultneamente.
el mtodo es universal en su aplicacin de manera que el tipo de
clulas , tamao y forma o la presencia/ausencia de paredes
celulares no altera significativamente su eficacia.
En vista de esto, el mtodo de bombardeo de partculas usando
microproyectiles se convirti en uno de los mtodos ms
prometedores para la transferencia de genes , pero dado del
xito posterior con la transferencia de genes mediada por
Agrobacteriutn en los cereales y otros materiales difciles , este
mtodo apenas se usa ahora.

Mtodo de Electroporacin

Mtodo de electroporacin
para la transferencia de
genes
Basado

Impulsos
elctricos cortos
de alta integridad,
aumentado
la
permeabilidad del
protoplasmas de
la clula.

Prueba de
Transformacin

El ADN esta en
contacto directo con
la
membrana,
lo
tanto es considerada
como una tcnica
eficiente. Pero en
ciertos casos no es
posible
la

Mtodo de electroporacin para la

transferencia de genes
La
electroporacin
se
genera
mediante
descargas
de
un
condensador a travs de
electrodos especialmente
diseados. Se da una
tensin de 1,5 Kv de pulso
de onda rectangular de
corta duracin o de 350 v
pulso de larga duracin

posomas (transferencia de gene

Liposomas.
Pequeas
bolsas del
lpidos.

Pueden
fusionarse
mediante
dispositivos
como PEG

OCURRE EN 3 pasos
- Adherencia de los
liposomas
- Fusin de los
liposomas.
Liberacin
de
plsmidos

Otros Mtodos
Mtodo
de
precipitacin de
fosfato
de
calcio.
El ADN es liberado
en el interior de la
clula mediante la
precipitacin
de
Ca.

Incubacin
de
grano
seco,
embriones,
clulas o tejidos
en el ADN.
AND viral. Ha sido
probado en muchos
casos y e expresin
de genes.

Transformacin
mediante
el
polen o el tubo
polnico.
Germinacin por de
polen
y
puede
integrarse
en
ncleos
de
espermatozoides a
travs
del
tubo
polnico.
Transformacin
por
ultrasonicacin
ADN
plasmidicos
sonicado.
Investigaciones en
el
centro
de
investigacin
en
biotecnologa
de
Beijing