IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION MOLECULAR

IDENTIFICACION Y
CARACTERIZACION
MOLECULAR

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AISLAMIENTO DE ADN

http://www.dakotacom.net/~clamunyon/F01MolGen/F01MolGenSyl.html

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ELECTROFORESIS DE ADN

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ELECTROFORESIS DE ADN

http://www.mun.ca/biology/scarr/2250_Genetic_Engineering_2003.htm

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ELECTROFORESIS DE ADN

http://www.mun.ca/biology/scarr/2250_Genetic_Engineering_2003.htm

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ELECTROFORESIS DE
ADN

http://www.mun.ca/biology/scarr/2250_Genetic_Engineering_2003.htm

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ELECTROFORESIS DE
ADN

http://www.mun.ca/biology/scarr/2250_Genetic_Engineering_2003.htm

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ELECTROFORESIS DE
ADN
http://cwx.prenhall.com/horton/medialib/media_portfolio/22.html

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ELECTROFORESIS DE ADN

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/education/images.shtml

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ELECTROFORESIS DE
ADN

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/education/images.shtml

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SDS-PAGE

SDS-PAGE

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SOUTHERN
BLOTT

http://lsvl.la.asu.edu/resources/mamajis/southern/southern.html

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ENZIMAS DE
RESTRICCION

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TRANSFORMACION

http://wps.prenhall.com/wps/media/objects/376/385232/Media-Portfolio/index.html

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TRANSFORMACION

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http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/education/images.shtml

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HIBRIDACION in situ

http://www.irn.pdx.edu/~newmanl/GraphicsCatalog.html

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HIBRIDACION in situ
http://www.irn.pdx.edu/~newmanl/GraphicsCatalog.html

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SECUENCIACION

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REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

(PCR)

Desarrollada por Kary Mullis, 1987.

Premio Nobel, 1993

Enzima DNA polimerasa.

Sntesis enzimtica "in vitro" de millones de copias a

partir de un segmento de DNA.

La reaccin: apareamiento oligonucletidos

dependiente y polimerizacin enzimtica

http://www.agen.ufl.edu/~chyn/age4660/lect/lect_07/lect_07.htm

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1. Desnaturalizacin:
Calentar a una alta temperatura
94 95C para denaturar DNA
DNA, DNA-primer, y primer
dimer.
2. Alineamiento:
Enfriar a una temperatura que
permita el alineamiento.
3. Extensin:
Calentar a ~72C para la ptima
incorporacin de dNTPs.
http://www.agen.ufl.edu/~chyn/age4660/lect/lect_07/lect_07.htm

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REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

(PCR) PUEDE SER UTILIZADA PARA
MULTIPLICAR REGIONES ESPECFICAS DEL
DNA DE CUALQUIER MICROORGANISMO QUE
VIVA EN O SOBRE UNA PLANTA, ANIMAL O
HUMANO (BUENO OTRO ANIMAL)

NO ES NECESARIO PURIFICAR EL ORGANISMO

Y AS SE PUEDE EVITAR EL CULTIVO EN
LABORATORIO.

LYON, B., BECERRA-LOPEZLAVALLE, A. Molecular Diagnosis of Fungal Pathogens in Cotton.

2003.

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SE ESCOGE UNA SECUENCIA COMO UNA

REPRESENTACIN DE TODO EL GENOMA
DEL MICROORGANISMO.
Los anlisis genotpicos tienen mltiples
ventajas:

Rapidez
Sensibilidad
Especificidad
Datos estandarizados y fcilmente
cuantificables.

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La PCR necesita ser combinada con:

Mtodos de preparacin de la muestra.

Mtodos para la deteccin.
Mtodos anlisis.

NYGREN, M. Molecular Diagnostics of Infectious Diseases. Royal Institute of Technology. Department

of Biotechnology. Stockholm. 2000.

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http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/education/images.shtml

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TERMOCICLADOR

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RT-PCR

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REAL TIME PCR

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ANLISIS PLASMDICO
Consiste en obtener los plsmidos de cada aislado y
separarlos por electroforesis en geles de agarosa
para determinar su nmero y tamao, fue una de las
primeras tcnicas empleadas en diferentes
microorganismos (Mayer, 1988)
Una forma sencilla de mejorar esta tcnica consiste
en digerir con enzimas de restriccin los plsmidos
aislados y as comparar los patrones obtenidos con
diferentes cepas (Maslow y cols., 1993)
Es una tcnica limitada a cepas con presencia de
plsmidos y que dichos plsmidos son por naturaleza
inestables y mviles, por lo que cepas
epidemiolgicamente relacionadas pueden presentar
diferentes patrones (Mickelsen y cols., 1985)

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REA (Anlisis de Restriccin Enzimtica)

Consiste en la digestin del DNA cromosmico total
mediante endonucleasas de alta frecuencia de corte y
su posterior electroforesis en geles de agarosa.
El REA tiene el inconveniente de que produce un
nmero excesivo de bandas, lo que hace
prcticamente imposible comparar un elevado nmero
de cepas
Este problema puede solucionarse transfirindo los
fragmentos de DNA separados en el gel a una
membrana de nylon para su posterior hibridacin con
una sonda que contenga los genes que codifican para
el rRNA (Grimont y Grimont, 1986; Altwegg y Moyer,
1989)
sta tcnica recibe el nombre de ribotipado y reduce
las bandas o marcadores a un nmero de entre 5 y 20

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PFGE (Electroforesis de campo
pulsado)

Se basa en el empleo de
endonucleasas de baja
frecuencia de corte y posterior
electroforesis en campo pulsado,
permitiendo el anlisis de
fragmentos de DNA ms grandes
que los obtenidos con el REA (10
- 800 Kb) (Arbeit y cols., 1990;
Maslow y cols., 1993)
Tericamente el PFGE se define
cmo una tcnica ltamente
reproducible, ya que los
patrones pueden resolverse bien
en un nico gel de agarosa y
representan el genoma completo
de la bacteria, y aplicable a
cualquier cepa bacteriana
(Maslow y cols., 1993)

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AFLP (Polimorfismos de fragmentos de

amplificacin)
Fragmentos de DNA (80-500
bp) obtenidos a partir de
endonucleasas de restriccin,
seguido de la ligacin de
adaptadores de
oligonucletidos a los
fragmentos y la amplificacin
selectiva por PCR
Marcador altamente
informativo, aplicado en
estudios que involucran
identidad gentica,
parentesco e identificacin de
clones y cultivares.

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AFLP (Polimorfismos de fragmentos de

amplificacin)

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AFLP (Polimorfismos de fragmentos de

amplificacin)

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16S-23S ITS (Espaciador intergnico 16S-23S)

En bacterias el opern ribosmico contiene los genes
organizados secuencialmente en el siguiente orden:
16S-23S-5S
Entre stos genes se encuentran los ITS que contienen
genes que codifican para tRNA y secuencias diana para
la RNasa III
La secuenciacin del 16S-23S ISR en numerosas
especies bacterianas ha demostrado que existen
variaciones importantes en la secuencia y longitud de
sta regin
La mayora de bacterias tienen mltiples copias del
operon ribosmico, incrementando la posibilidad de que
existan diferencias en el 16S-23S ISR ente diferentes
cepas, especies y gneros

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16S-23S ISR (Espaciador intergnico 16S-23S)

Adems se trata de una regin sin actividad
codificante por lo que presenta un ritmo evolutivo
rpido.
Ello hace posible la utilizacin de esta regin con
fines taxonmicos y epidemiolgicos (Grtler y
Stanisich, 1996).
De hecho, el anlisis completo del 16S-23S ISR o de
sus patrones de RFLP, obtenidos tras digestin
enzimtica, ya han permitido tipar con xito cepas
implicadas en procesos epidemiolgicos en distintos
gneros bacterianos (Kostman y cols., 1995; Abed y
cols., 1995; Cartwright y cols., 1995; Garca-Martnez y
cols., 1996).

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16S-23S ITS (Espaciador intergnico 16S-23S)

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16S-23S ITS
(Espaciador intergnico 16S23S)

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RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD)

Fragmentos amplificados por PCR,

utilizando decanucletidos
sintticos aleatorios, que sirven
como primer forward reverse.

Amplifican fragmentos de 0.5-5kb,

que son separados en
electroforesis y el polimorfismo es
detectado como la presencia o
ausencia de bandas de un tamao
particular.

No se requiere informacin de
secuencia para la construccin de
los primers.

Distribucin aleatoria a lo largo

del genoma, permite estudios de
mapeo gentico.

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SEQUENCE CHARACTERIZED AMPLIFIED REGION (SCARs)

SCARs son fragmentos de DNA amplificados por

PCR, utilizando primers especficos de 15-30 bp.

Diseados a partir de secuencias de nucleotidos

establecidas a partir de RAPD.

Al utilizar iniciadores ms largos se evita el

problema de la baja reproducibilidad de los RAPDs.

Los SCARs han sido aplicados en estudios de mapeo

gentico, seleccin asistida por marcadores.

MICROSATLITES

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Marcadores moleculares de loci, unidades repetidas en

tandem de motivos nucleotidicos muy cortos (1-5 pb).

Cuando se conoce la secuencia de nucletidos que

delimita la regin microsatlite, se disean iniciadores
especie especficos, para amplificar esta regin.

Alto nivel de polimorfismo, marcadores informativos

para estudios de gentica de poblaciones, nivel de
individuo (identificacin de cepas).

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Rep-PCR
Es una tcnica alternativa al RAPD dado que se basa en
la PCR de regiones conservadas del genoma
Al igual que en el caso del RAPD es necesaria una
minuciosa estandarizacin de la tcnica para asegurar
su reproducibilidad (Tyler y cols., 1997)
Dentro de ste grupo de tcnicas se encuentran el REP
y el ERIC. El REP son regiones de entre 33 y 40 pb que se
repiten entre 500 y 1000 veces en el genoma de
Escherichia coli y Salmonella typhimurium, ocupando
aproximadamente el 1% de su genoma (Stern y cols.,
1984)
El ERIC son regiones de entre 124 y 127 pb que se
repiten entre 30 y 150 veces en el genoma de las
Enterobacterias (Hulton y cols., 1991)

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Rep-PCR

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PODER DISCRIMINATIVO DE LAS TCNICAS DE TIPADO

(Adaptado deSavelkoul y cols., 1999).

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MICROARREGLOS

Mezcla de biomolculas y
microchips, para
deteccin e identificacin
de secuencias de cidos
nucleicos.