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BIOSENSO
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DIAGNO
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INMUNO DEF

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BIOS

INTRODUCCION

 El virus de inmunodeficiencia humana

identificado en 1983 es un retrovirus que
ataca a las clulas del organismo que
expresan el receptor CD4 en su superficie
unindose mediante la glicoprotena
gp120 de su membrana para luego
penetrar en las clulas. Una vez en el
interior de las clulas la transcriptasa del
VIH transcribe el ARN viral a ADN el cual
se incorpora al ADN de la clula, stas son
infectadas y mueren liberando viriones los
cuales contaminan las dems clulas.

Una alternativa prometedora

para el diagnstico de VIH son los
biosensores, son pequeos
dispositivos capaces de
cuantificar concentraciones de
sustituyentes qumicos y
convertir esta informacin en una
seal medible.

En los ltimos aos los sensores

electroqumicos han cobrado mucha
importancia en el campo de las
determinaciones analticas ya que estos
permiten obtener seales medibles y de
fcil interpretacin, ofrecen trabajar con
volmenes pequeos y se pueden realizar
pruebas por ser posibles de integrarse a
kits porttiles, estos dispositivos son de
fcil manejo, abaratan costos y los
tiempos de respuesta son inmediatos.

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FUNDAME
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BIOSENSO
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INMUNODEF

BIOSENSORES

Un sensor qumico puede definirse

como un pequeo dispositivo capaz de
cuantificar concentraciones de
constituyentes qumicos y convertir
esta informacin, en tiempo real, en
una seal medible.

Un biosensor se define como un

tipo especfico de sensor qumico
constituido por dos partes
integradas: un elemento de
reconocimiento biolgico o
biorreceptor y un transductor
fisicoqumico.

BIORRECEPTOR
TRANSDUCTOR

La utilizacin del biorreceptor

aporta selectividad y pueden
emplearse protenas, cidos
nucleicos, microorganismos,
organelas, o tejidos. La eleccin
del material biolgico depende
de las caractersticas del analito.

 BIOAFINIDAD
ANTICUERPO
DIRECTA
ELECTROQUMICO

Recuento
de linfocitos
T CD4+
Son un
subgrupo
delinfocitos(a
su vez un tipo deleucocito) que
tienen un papel muy importante
en establecer y maximizar las
capacidades de defensa
delsistema inmunitario.

Cd4 es el grupo de proteinas que

conforman el receptor de pared
celular

6-10 micras

 Este mtodo de recuento de linfocitos

T CD4 con biosensores surgen tras la
necesidad de disear mtodos nuevos,
simples y accesibles.

El sistema de deteccin se basa en

una enzima modificada genticamente
y una pequea red de micro
electrodos.

Chip 3x3 mm

PARTE EXPERIMENTAL
La tcnica consiste en el
aislamiento de las clulas CD3+,
que es el marcador molecular de
linfocitos totales (T) mediante
partculas
magnticas
modificadas con anticuerpo antiCD3 (antiCD3-MP).
Un aumento en la seal del
biosensor indicara, un aumento
en la concentracin de enzima

El Equipo que se utiliza para

las medidas electroqumicas
utiliza un sistema de tres
electrodos:
Uno de referencia Ag/AgCl
con solucin interna de
KNO3 saturada con AgCl y
solucin externa 0.1 M de
KCl
Uno auxiliar de Pt

Construccin y
caracterizacin de los
electrodos magnticos
basados en compsitos de
grafito-epoxi (m-GEC)
La construccin del cuerpo del
magneto
electrodo
m-GEC
consisti en la incorporacin de
una conexin metlica en el
interior de un tubo de PVC de
22 mm de longitud, dejando

Materiales utilizados y Fabricacin de los mismos

Preparacin de electrodos
magnticos basados en un
compsito de grafito-epoxi
(mGEC)
La pasta de compsito utilizada
para la construccin de los
electrodos consisti en una
mezcla de polvo de grafito con
resina epoxi.

 Es importante depositar una

fina capa de compsito sobre
la placa de cobre para evitar
que el imn entre en contacto
con sta
Los electrodos fueron curados
durante
7
das
a
una
temperatura
de
80
C,
obtenindose
un
material

CARACTERIZACIN DE LOS
TRANSDUCTORES
ELECTROQUMICOS BASADOS
GRAFITO-EPOXI
(MGEC)
La operatividad
y funcionalidad
de los
EN
transductores desarrollados se caracteriza
electroqumicamente, mediante
voltamperometra cclica, utilizando el
sistema redox hidroquinona
1,4dihidroxibenceno/benzoquinona.

En los anlisis amperomtricos posteriores se

utilizara
hidroquinona
electroqumico.

como

mediador

ensaya por la adicin de una

solucin de hidroquinona 1.8
mmol L -1 a 20 ml de tampn
PBS2.
Los
parmetros
instrumentales de la tcnica son:

Mediante

esta
tcnica
se
determina el potencial a aplicar
en los ensayos amperomtricos y
la
reproducibilidad
de
construccin de las magnetos

uno biosensor
de los electroqumico
ensayos se
realizada
Magneto
para
la
Cada

de linfocitos T CD4+
en un determinacin
tubo de poliestireno
con fondo
en U y las reacciones de captura.

Las

concentraciones utilizadas fueron

las siguientes:

[anticd3-mp] = 8.106ng/ml
[Anticd4-biotina] = 60 ng/ml
[Estrepav-hrp] = 50 g/ml.

Una

vez realizados los lavados de la

marcacin secundaria, las clulas
unidas
a
las
partculas,
son
resuspendidas en un volumen de 140
l y son capturadas por el magneto
electrodo m-gec.

Para

ello se introduce el magneto

electrodo mgec en posicin invertida
dentro de los tubos, de modo que las
partculas magnticas son atradas por el
imn que forma el electrodo. De este
modo
quedan
retenidas
sobre
la
superficie del electrodo. Una vez que la
muestra se encontr inmovilizada sobre la
superficie del magneto electrodo, se
realiz la medida amperomtrica a travs
de la determinacin de la respuesta
enzimtica de la HRP aplicando un
potencial de trabajo de -0.150 v.

mmol/L de sustrato enzimtico

(H2O2)
y
1.8
mmol/L
de
hidroquinona (mediador), en la
solucin tampn PBS2. Esta seal
analtica es proporcional a la
actividad de la enzima ya que se
trabaja
en
saturacin
de
sustrato, y por tanto, se obtienen
valores de intensidad mxima.

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APLIC

 Se plantea el diseo de una

estrategia con deteccin ptica as
como un dispositivo magneto
biosensor electroqumico para el
diagnstico de sida a travs del
recuento de clulas marcadoras de
la enfermedad presentes en la
sangre.

Ambas estrategias se basan en la

captura inmunomagntica de
linfocitos t cd4+ con partculas
magnticas modificadas con
anticuerpos monoclonales
especficos (anti-cd3)

anticuerpo primario anti-cd4

marcado con biotina (anticd4biotina) y con un conjugado de
estreptavidina y de la enzima
HRP (peroxidasa de rbano
picante). La unin de esta
enzima al anticuerpo primario
se realiza a travs del complejo.
Se proponen dos tipos de
sistemas de deteccin: ptico y
electroqumico

complejos celulares de linfocitos T

formados con las partculas
magnticas a diferentes relaciones
de cantidades, mediante la
captacin inmunomagntica de
linfocitos T CD4+ ) por las partculas
magnticas modificadas con
anticuerpos especficos anti-cd3
(anticd3-mp).

La microscopa electrnica de

BIOSENSOR PARA EL DIAGNSTICO Y SEGUIMIENTO DE INMUNODEFICIENCIAS .

barrido (SEM) ES utilizada para

caracterizar los complejos formados
entre los linfocitos T y las partculas
magnticas durante la
inmunoseparacin magntica basada
en la interaccin inmunolgica de los
receptores CD3 de linfocitos T con
anticuerpos especficos anti-cd3 de
las partculas magnticas, es decir,
en presencia de exceso de partculas
magnticas.

la figura , se basa en la captura

inmunomagntica de linfocitos T CD3+
RESULTADOS
y en la deteccin amperomtrica de
linfocitos T CD4+ mediante el uso de
magneto electrodos, y fue evaluada
en el valor umbral para recibir o no
tratamiento antiviral de 200 LT CD4+
ug/L de sangre.

La figura

muestra la potencial
capacidad de discriminacin que
presenta el mtodo desarrollado para
determinar cundo una persona
infectada con el vih debera comenzar

Magneto biosensor
electroqumico para el recuento
de linfocitos T CD4+ basados en
magneto electrodos m-GEC.

 El comportamiento electroqumico
de los magneto electrodos m-gec
CONCLUSIONES

(basados en compsitos grafitoepoxi) muestra una buena

reproducibilidad entre magneto
electrodos de un mismo lote,
preparados en las mismas
condiciones.
El mtodo magneto-elisa
desarrollado resulta til para el
diagnstico y seguimiento de
infecciones por vih ya que es capaz
de discriminar diferentes
concentraciones de linfocitos t cd4+

biosensor electroqumico
presenta una capacidad
potencial de deteccin de
linfocitos T CD4+ de forma
descentralizada y utilizando
instrumental sencillo y
porttil.
Se ha conseguido desarrollar
un mtodo de deteccin de
linfocitos t cd4+ que requiere
un tiempo de anlisis corto y
considerablemente ms
econmico respeto a otros
mtodos clsicos de recuento

GRACIAS