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e
applicazioni del DNA ricombinante
Le Biotecnologie sono un insieme di tecniche che
utilizzano organismi viventi (batteri, lieviti, cellule
vegetali, cellule animali) o componenti subcellulari
BIOTECNOLOGIE BIOTECNOLOGIE
TRADIZIONALI: INNOVATIVE:
utilizzano le trasmissione di
proprietà dei caratteri anche tra
microrganismi per la organismi di specie
fermentazione di diverse,
cibi e bevande modificando il loro
patrimonio
genetico
Lievitazione: aumento di volume per azione dei gas durante la
fermentazione dovuta
al lievito.
Formaggi Formaggi
a pasta dura teneri
Nella preparazione del burro occorre separare il grasso dalla panna;
per far ciò è necessaria una iniziale acidificazione della panna ad
opera dei batteri lattici (streptococchi). Questi batteri producono
anche piccole quantità di acetoina, una proteina che si ossida
spontaneamente e forma il diacetile, un composto che conferisce al
burro un odore gradevole.
La fermentazione determina:
galattosio
Lattosio
glucosio Acido piruvico Acido lattico, responsabile dell’acidità
e della parziale coagulazione del latte
(consistenza cremosa)
La produzione di vino si basa sulla fermentazione di zuccheri
(glucosio e fruttosio) presenti nel succo d'uva ad opera di
lieviti.
Temperatura di
fermentazione:21°-24°C.
La fermentazione dura 3-5 giorni
I lieviti contribuiscono direttamente ed indirettamente alle caratteristiche
aromatiche di un vino.
Dalla disamina del DNA della vite è emerso che ci sono ben 43 geni per
la produzione di resvertrolo, la molecola antiossidante divenuta
famosa per i suoi effetti allunga-vita su animali.
L'alcool prodotto ha anche la capacità di estrarre il colore dalle
bucce dell'uva.
mosto
coltura su
terreno
selettivo
diluizioni seriali
isolamento
purificazione
collezione
Batteri lattici: fermentazione lattica
f.malolattica, positiva nei vini rossi da
invecchiamento
biologia molecolare
biologia genetica
chimica fisiologia
biochimica micr
icroobio logi
biolo giaa
L'Ingegneria genetica è l'insieme delle tecniche
che consentono di modificare in modo stabile
e mirato, il patrimonio genetico di un
organismo.
2. Ligazione del frammento di DNA con un vettore di clonaggio
mediante la DNA ligasi.
4. Isolamento e purificazione del clone desiderato.
5. Produzione di un elevato numero di cellule o batteriofagi
contenenti il clone desiderato per l'isolamento e lo studio del DNA
clonato.
Isolamento del DNA.
o DNA stampo
(anche 1 sola
copia!!!)
o Primers (inneschi)
oligonucleotidi sintetici (12-15 basi)
complementari alle estremità 5’ e 3’ del
frammento
o dNTP (ATP, TTP, CTP, GTP)
E’ un termostato automatico
capace di modificare la
temperatura dei tubi di
o Taq polimerasi reazione in tempi molto brevi
(DNA polimerasi da Thermus
aquaticus)
100 bp 2 4 6 100
bp bp
1 3 5 7
ladder K- ladder
1500
1250
1031
900
800
700
600
500
La PCR ha trovato molte applicazioni pratiche.
• elettroeluizione
• colonne a scambio ionico
• gel-filtration
• ultrafiltrazioni
• agarosio a basso punto di fusione
• ecc. ecc.
Vettori di clonaggio
- Plasmidi
- Cosmidi
- Batteriofagi
- Virus
1. temperatura e al tempo di
reazione
2. alla concentrazione totale del
DNA
3. alla concentrazione dell’inserto e
del vettore.
Ospiti per i vettori di clonaggio
1. crescita rapida,
2. capacità di crescere in terreni di coltura poco costosi,
3. non patogenicità,
4. capacità di essere trasformato con DNA
5. stabilità in coltura.
Tecniche di trasferimento genico in cellule :
cuvette
Metodi fisici:
•Iniezione diretta:
• Gene
Gun
Il DNA viene accoppiato ad un solido inerte (solitamente particelle
di oro) e sparato direttamente nella cellula.
Può essere utilizzato anche su interi organismi e per la
trasformazione delle piante.
Metodi chimici
Uno dei metodi più semplici e
meno costosi è quello che utilizza
il calcio fosfato.
La procedura prevede il
mescolamento di una soluzione
tampone HEPES contenente ioni
fosfato insieme a una soluzione di
cloruro di calcio (CaCl2) e il DNA da
trasfettare. Il mescolamento delle
due soluzioni produce un
precipitato di calcio fosfato, che
andrà a legare la molecola di DNA.
Il precipitato viene prelevato,
risospeso e aggiunto al terreno di
coltura (di solito una coltura mono
strato). Con un processo ancora
non ben noto le cellule legano il
precipitato e permettono
l'ingresso del DNA.
Trasduzione:
Il DNA può infine essere inserito per trasduzione. Per questo
vengono di solito utilizzati adenovirus, retrovirus e lentivirus.
Un altro metodo biologico molto efficace
sfrutta i liposomi, piccole vescicole lipidiche
che inglobano il DNA e sono indotte ad
entrare con esso nella cellula simulando i
processi di endocitosi cellulare.
Piante
• elettroporazione Lieviti
• trasferimento mediato da Agrobacterium • PEG
• cannoncino balistico • Elettroporazione
• fusione di protoplasti
Selezione dei ricombinanti
Schema di
generazio
ne
di un topo
transgenic
o.
o Quando i ricercatori isolano un gene umano dalle funzioni ignote,
per comprenderne la funzione inseriscono nel topo una sequenza
inattiva del gene isolato, rimpiazzando quello stesso gene
presente nell'animale. In questo modo viene creato un particolare
tipo di topo transgenico, il topo knock-out, privo cioè di quella
certa funzione genica.
Basterà quindi osservare il topo knock-out per comprendere la
funzione del gene in questione (ad esempio, se il topo perde
l'udito, si deduce che il gene in questione è coinvolto nei
meccanismi dell'udito, e la sua alterazione provoca la sordità).
o L'uso del topo per questi scopi nasce dalla particolare similitudine
tra il genoma umano e quello del roditore.
Medicina e farmacologia
Diagnostica
Produzione farmaci
Produzione altre sostanze
Terapia genica
In precedenza, i farmaci venivano prodotti per sintesi
chimica o estratti da fonti naturali come, piante e
microrganismi. Altre sostanze, come ormoni, venivano
ricavate da animali, cadaveri o da sangue umano,
ottenendo quantità molto esigue, a costi elevati e col
pericolo di contaminazione virale.
Ormoni:
Somatotropina
il sistema è inducibile
Interferoni
Gli interferoni sono proteine prodotte da particolari cellule del sistema
immunitario, queste proteine sono presenti in piccolissime quantità e
sono solo estraibili dall’uomo, poiché quelli estratti da animali sono
strutturalmente diversi ed sono inutilizzabili per la difesa immunologia
nell’uomo.
Con batteri transgenici si possono produrre ingenti quantità, senza
particolari processi di lavorazione. (Es.: Interferone α-2a (E. coli),
Interferone α-2b (E. coli), Interferone β-1a(cellule CHO).
Enzimi:
DNasi umana (cellule CHO))
Vaccini a DNA.
Introduzione nell’organismo di DNA ricombinante contenente uno o più
geni che codificano per antigeni che vengono prodotti nell’organismo e
stimolano una risposta immunitaria protettiva
Alcuni importanti composti biotecnologici
prodotti con le tecniche del DNA ricombinante
Prodotto Funzione
Proteine del sangue
Applicazioni Attivatore del Dissolve i trombi
pratiche plasminogeno tissutale
Fattori VII VIII, IX Promuovono la coagulazione
dell’ingegneri Eritropoietina Stimola la crescita degli eritrociti
a genetica Urochinasi Dissolve i trombi
Ormoni
Insulina Trattamento dei diabete
Ormone della crescita umano Trattamento dei nanismo
Fattore di crescita cicatrizzazione delle ferite
epidermico
Ormone paratiroideo Regolazione del calcio
P-Endorfina Antidolorifico
Fattore di crescita osseo Osteoporosi
Atriopeptina Diuretico, antipertensìvo
Immunomodulatori
Interferoni Agenti antivirali e potenzialmente antitumorali
Interleuchina 2 Stimolatore dei linfociti T
Fattore di necrosi tumorale Agente antitumorale
Fattore di stimolazione delle colonie Trattamento delle infezioni e del cancro
di granulociti e macrofagi
Lisozima Antinfiammatorio
Voccini
Epatite B Prevenzione delle epatiti da siero
Citomegalovirus Prevenzione delle infezioni
Morbillo Prevenzione dei morbillo
Colera Prevenzione dei colera
AIDS Prevenzione dell'AIDS
Rabbia Prevenzione della rabbia
Esempi di prodotti
industriali ottenuti
mediante l’impiego
di microrganismi
Applicazioni in prospettiva:
Uno dei più grandi obiettivi della medicina genetica è quella di curare
malattie genetiche, provocate da alterazioni di uno o più geni o da malattie
ereditarie, come la talassemia, la distrofia muscolare di Duchenne e la
fibrosi cistica.
Una volta individuato il gene difettoso, si disattiva e si sostituisce con
quello funzionante (Immunizzazione genica).
Questa operazione viene effettuata su cellule somatiche ma potrebbe
essere effettuata anche su quelle germinali modificando il patrimonio
genetico dei discendenti.
Fermentazioni microbiche.
Numerosi prodotti, soprattutto antibiotici, vengono prodotti
industrialmente usando microrganismi. Le tecniche dell'ingegneria
genetica possono essere sfruttate per manipolare gli organismi in
grado di produrre antibiotici, al fine di aumentarne la resa o
produrre molecole modificate, più efficaci e meno tossiche,
abbassando i costi.
- Oltre 6000 antibiotici isolati da vari microrganismi
- 100/200 antibiotici scoperti all’anno, di cui solo 1% entra in
commercio.
- Streptomyces: principale organismo utilizzato per produrre
antibiotici.
La composizione del terreno influenza
enormemente la produzione degli
antibiotici: il terreno ideale è quello
che risulta più vantaggioso in termini
di costi per unità di prodotto.
LIMITI:
• casualità
Eventuali rischi:
Per la salute:
salute
tossicità e allergie derivanti dalla presenza
nell’OGM di sostanze provenienti dalla specie
“donatrice” di uno specifico tratto
Resistenza ad antibiotici dovuta a geni
marcatori
Per l’ambiente:
Diffusione di caratteri modificati nell’ecosistema
(proliferazione di infestanti resistenti a specifici
prodotti chimici, alla crescita dei predatori,…)
Gli OGM sono strettamente legati ad un modello
di produzione agricola che provoca una forte
riduzione della biodiversità