Vous êtes sur la page 1sur 13

PURIFICACIN DE

PROTENAS

GENERALIDADES SOBRE
PURIFICACION DE
PROTENAS
El mtodo de purificacin debe disearse desde un principio
teniendo en cuenta la cantidad de protena que se requiere. Hay
etapas de purificacin que se pueden aumentar de escala
fcilmente y otras en que no es posible hacerlo. El grado de pureza
necesario depender del uso que se va a dar a la protena. Para
usos en investigacin, la escala es reducida y es mas importante la
pureza que el rendimiento. Para usos teraputicos la escala es
mayor y la pureza requerida es mxima. Para usos industriales,
frecuentemente se requiere gran cantidad, bajo costo y pureza
menor.

Si el inters est en la protena y no importa el organismo de


origen, conviene buscar una fuente fcil de obtener, barata, que
contenga esa protena en abundancia. Si existe la posibilidad de
partir de organismos enteros o de clulas en cultivo, esto ltimo es
en general preferible. Lo ptimo es producir la protena por
mtodos de DNA recombinante. Dependiendo de la finalidad, la
protena debe ser obtenida en estado nativo o puede estar
desnaturalizada. Para actividad biolgica, debe estar nativa; para
determinar estructura primaria, puede estar desnaturalizada.

Se debe seleccionar un mtodo de determinacin especfico de la


protena en cuestin (p.ej.: actividad, si se trata de una enzima;
unin de ligando a un receptor; unin de un anticuerpo especfico
en un RIA) y un mtodo de determinacin de la protena total. Debe
tenerse en cuenta que, salvo la determinacin de protena por
anlisis de aminocidos o por peso seco, todos los dems mtodos
son semicuantitativos, a menos que se los estandardice con la
propia protena en estudio.

ESQUEMA GENERAL DE UN
METODO DE PURIFICACION
1) Separacin de las clulas.
2) Si la protena es intracelular, ruptura celular y separacin de
restos.
3) Concentracin.
4) Aislamiento primario.
5) Purificacin de alta resolucin.
6) Pulido del producto final.

PROBLEMAS A SER
RESUELTOS PARA DISEAR
EL PROCESO
1) Elegir etapas basadas en diferentes principios fisicoqumicos.
2) Elegir entre operaciones alternativas, en base a la escala final
buscada.
3) Disear una secuencia de etapas ptima, con el menor nmero
de etapas posible, lo que aumentar el rendimiento final.
4) Minimizar la desnaturalizacin y efectos de superficie; evitar
agregacin: minimizar la degradacin; cuidar la limpieza y
desinfeccin del equipo usado.

METODOS PARA LA
RUPTURA DEL MATERIAL
A menos que se trate de una protena extracelular, liberada al
medio, las clulas o tejidos deben romperse para extraer la
protena de inters. Esta ruptura debe ser slo la necesaria, no
excesiva, para evitar la extraccin intil de protenas
contaminantes. Los distintos tipos de clulas tienen diferente
susceptibilidad a la ruptura.
Las clulas animales son muy fciles de romper, pues carecen de
pared. Las vegetales tambien, pues, pese a tener pared celular, su
gran tamao las hace vulnerables a la ruptura mecnica.

Las clulas bacterianas son ms resistentes, y esta propiedad


depende de que sean Gram positivas o Gram negativas. El
predominio del peptidoglicano en la pared de las primeras, las hace
mucho mas sensibles a mtodos suaves, como la digestin con
lisozima. Los hongos filamentosos y las levaduras son los ms
resistentes a la ruptura. Tienen paredes celulares que contienen
hasta 80 - 90 % de polisacrido (quitina y glicanos en hongos,
manano y glucano en levaduras), adems de lpidos y protenas.

ALGUNOS METODOS DE
RUPTURA DE CELULAS
1) Mortereado con arena, almina, bolitas de vidrio, carburo de silicio.
2) Molinos de ruptura, por agitacin con abrasivos.
3) Uso de licuadoras u otros dispositivos con cuchillas rotativas.
4) Sonicacin.
5) Congelacin y descongelacin.
6) Extrusin de lquido o slido (material congelado)
7) Descompresin explosiva.
8) Enzimas lticas, seguido por shock osmtico o tratamiento mecnico.
9) Detergentes (Triton, digitonina) o solventes (tolueno).
10) Aislamiento previo de la organela en que se encuentra la protena.

METODOS GENERALES DE
PURIFICACION DE
PROTEINAS.
1)Ruptura del material y obtencin de un extracto libre de clulas.
2)Precipitacin (sales, pH, alta temperatura, solventes orgnicos).
3)Dilisis o ultrafiltracin. Concentracin.
4)Fraccionamiento cromatogrfico.

CROMATOGRAFIA
Separacin diferencial de los componentes de una muestra entre
una fase mvil y una fase estacionaria. La fase mvil es el solvente
en que se introduce la muestra y con el que se eluyen las protenas
(puede ser el mismo o variar durante la corrida). La fase
estacionaria comprende las partculas, en general esfricas, con
que se llena la columna. Estas partculas estn formadas por una
matriz y, en la mayora de los casos, molculas de menor o mayor
tamao con las que se la derivatiza, para adaptarla a los diferentes
procedimientos cromatogrficos.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Corridas a presin normal (LPLC, low-pressure liquid
chromatography). Presin inferior a 5 bar. Pueden usarse matrices
de escasa rigidez, como la agarosa o el dextrano. 2. Corridas a
presin intermedia (MPLC, medium-pressure liquid
chromatography, tambien llamada FPLC (Fast protein liquid
chromatography). Presin entre 6 y 50 bar. Requiere matrices mas
rgidas. Permite flujos mayores. 3. Corridas a alta presin (HPLC,
high-pressure - o high-performance - liquid chromatography).
Presiones mayores de 50 bar. Requiere matrices de rigidez alta,
partculas pequeas y columnas y tuberas de material altamente
resistente a la presin, como el acero inoxidable o el titanio.

La matriz es el sustrato slido de la fase estacionaria. Las ms


comunes son celulosa, dextrano, agarosa, poliacrilamida y silica.
Deben tener buena estabilidad mecnica y qumica, alta capacidad,
tamao y forma adecuada de poros, superficie inerte para
minimizar las interacciones no especficas, y tamao de partcula
adecuado al flujo de solvente deseado y a la presin operativa.