UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN

NICOLAS DE HIDALGO
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES
QUIMICO BIOLOGICAS

MAESTRIA EN CIENCIAS EN BIOLOGIA EXPERIMENTAL

MICROBIOLOGIA
ESTUDIO ACTUAL DE LOS MICROORGANISMOS
Y METAGENOMICA

Biol. Mariana Gmez Barroso

QFB. Martha Alicia Mndez Camari
QFB. Mayra Xochitl Durn Maldona
QFB. Brian Gmez

Introduccin
Los microorganismos tienen un papel importante en los ciclos
biogeoqumicos.
Influyen en los ecosistemas terrestres.
El conocimiento de la diversidad microbiana y su papel en el
medio ambiente son desconocidos.
Debido a su incapacidad de cultivarlas por desconocimiento de
sus requerimientos nutricionales y fisiolgicos de crecimiento .
Solo un pequeo nmero de microorganismos del suelo son
cultivables (Bacterias 0.1-10 %).

Limitaciones generales en el estudio de diversidad microbiana

Limitaciones en la metodologa y falta de conocimiento

taxonmico.
Heterogeneidad espacial
La diversidad microbiana presenta distintos niveles de
organizacin debido a las diversas interacciones biticas y
abiticas del entorno.
Incapacidad de cultivar microorganismos
Limitaciones de los mtodos moleculares (PCR)
1. Diferentes afinidades de los cebadores a las plantillas.
2. Eficiencia de la hibridacin.
3. Especificidad del primer.
4. Las secuencias pobres en G-C se separan ms
fcilmente y pueden ser amplificados
preferencialmente.

Mtodos de estudio de la diversidad microbiana

Mtodos Fenotpicos.
Mtodos Moleculares.
Mtodos Protemicos.

Mtodos Fenotpicos
Comparacin de las caractersticas fenotpicas de bacterias
desconocidas con aquellas de cultivos tipo.
La fiabilidad de la identificacin est en proporcin directa al
nmero de caractersticas similares.
Para la identificacin se toman los siguientes criterios:

Mtodos Moleculares
Permite establecer relaciones filogenticas entre bacterias.
El medio de cultivo se utiliza para la extraccin del DNA
cromosmico y la amplificacin.
Se basan en la amplificacin genes conservados.
Secuenciacin de genes o sus fragmentos.
Permite la identificacin de bacterias difciles de cultivar.

Genes utilizados
ARNr 16s
Distribuido universalmente y presenta un
alto grado de conservacin.
El gen presenta un tamao de 1.500 pb.
Presenta 9 zonas variables (v1-v9) son
usadas para la taxonoma comparativa.
Los cebadores universales son
complementarios a las zonas conservadas
del inicio del gen, zona 540 pb y al final
del gen.

rpoB (subunidad de la ARN polimerasa).

Sntesis del RNAm, RNAr y RNAt.
Compuesta por 5 subunidades (2, , y ).
La subunidad presenta la funcin cataltica.
Se distribuye universalmente en bacterias.
La secuencia de aminocidos deducida permite establecer
agrupamientos de especies bacterianas.

gyrB (subunidad de la topoisomerasa II)

Relacionado con la sntesis de DNA.
Compuesta por 2 monmeros (GyrA y GyrB).
La subunidad hidrolisis de ATP y la subunidad presenta
accin cataltica.
Presenta sustituciones sinnimas.
Establece diferencias inter e intraespecie.

Pasos para realizacin de las tcnicas de identificacin molecular

1.
2.
3.
4.

Extraccin del DNA cromosmico.

Amplificacin .
Secuenciacin del amplicn.
Anlisis de secuencias

Nuevas tecnologas en la identificacin molecular microbiana

PCR en multiplex acoplada a un anlisis de la temperatura de melting
(SeptiFast, Roche Diagnostics, Manheim, Germany).
Identifica de forma temprana a algunos agentes etiolgicos
bacterianos y fngicos de la sepsis a partir de muestra directa.
La regin amplificada es el espacio intergnico del 16S-23S
ARNr bacteriano o del 18S-5,8S fngico.
Plataformas de amplificacin-pirosecuenciacin.
Identificacin bacteriana o fngica mediante PCR de 3 regiones
variables del ARNr 16S (V1 V3, o V1, V2 y V6) y del ARNr 18S,
respectivamente, en hemocultivos
Amplicones (<500 pb) se determina su secuencia por la luz
emitida por la liberacin de pirofosfatos (Subproducto de
polimerizacin de la cadena).

Mtodos Protemicos

Protemica: estudio y caracterizacin de protenas expresadas por el

genoma.
Las tcnicas de protemica
Estudian el conjunto de protenas

A travs de electroforesis y espectrometra de masas.

Clasificacin de los mtodos protemicos

INTRODUCCION

Segn Robert Koch, un cultivo puro es la

base de toda la investigacin en
enfermedades infecciosas.

Aislamiento de una bacteria------modelo

experimental para analizar virulencia.

Susceptibilidad a antibiticos
Secuenciacin de l genoma
Manipulacin de genes

 ESTRATEGIAS TEMPRANAS Y PRINCIPIOS

GENERALES
Medios de cultivo empricos.
MEDIOS DE CULTIVO NO SELECTIVOS
Infusiones de carne, extractos de
corazn o cerebro.
Peptonas
Agar solido y suero coagulado
Medio enriquecido

 Medios de cultivo selectivos

Componentes y minerales orgnicos e

inorgnicos
Antibiticos y antispticos
Descontaminacin de la muestra
La temperatura
Atmosferas
Tiempo de incubacin
Mejora en colecta y tiempo de
transporte al laboratorio

 ESTRATEGIAS ESPECIFICAS PARA

BACTERIAS EXIGENTES
MYCOPLASMA
ANAEROBIAS
La reduccin fsica de la tensin de
oxigeno
La reduccin qumica por agentes
reductores
Mayores y menores constituyentes de
medios adecuados anaerbicos.
Factores de crecimiento

 ESPIROQUETAS

BORRELIA
TREPONEMA
LEPTOSPIRA

 MICOBACTERIAS
TUBERCULOSIS
LEPRA
ULCERA DE BURULI
Temperatura factor clave.
Autofluorescencia natural.
Micobacterias intra-amebas.

ARQUEAS

 Los protozoos utilizan para su cultivo

ARM
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Epsilonproteobacteria
Fimicultes
bacteroidetes
Actinobacteria
La clamidia
Endomicrobia
Phylum TM6

 CULTIVO DE CELULAS

 CONCLUSION

Metagenoma: conjunto de todos los genomas

de todos los microorganismos en un medio
ambiente determinado
Genoma: Conjunto de los genes de un
individuo o de una especie
Gen: Secuencia de ADN que
constituye la unidad funcional
para la transmisin de los
caracteres hereditarios

Metagenmica: obtener secuencias del genoma de los

diferentes m.o. (como bacterias) que componen una
comunidad, extrayendo y analizando su DNA de forma global
Posibilidad de secuenciar directamente genomas, sin necesidad
de cultivarlos. Funcin

Debido a que se sabe muy poco

acerca
de
las
comunidades
microbianas,
potencial
de
descubrimiento
es
grande
en
cualquier hbitat de estudio

En la Tierra no vivimos en la Era del Hombre o de los humanos, vivimos hoy, y

siempre, en la Era de la Bacterias. Stephen Jay Gould (1941-2002)

34 zonas distintas del ocano Pacfico, de la

superficie del suelo marino y hasta un metro de
profundidad.
Abundancia microbiana aproximadamente de 3 x
1029clulas

Nmero
muy amplio
para ser
estudiado
por cultivo

Amplificaciones de los genes ribosomales que codifican

para la subunidad 16s. Secuencia altamente conservada.
Construccin de bibliotecas metagenmicas

Tambin es
posible extraer
protenas o
ARN de las
muestras.

Escherichia
coli

Anlisi
s

Rutas
metablicas

Transferenci
a gnica

Filogenias

Metagenm
ica
comparativ
a

La capacidad de ensamblar los fragmentos de ADN

disminuye drsticamente con la complejidad del
ambiente muestreado

1 2 3 4

Figura 4. El mtodo de Maxam y Gilbert para secuenciar ADN. Los nmeros de los
carriles en el gel corresponden a los distintos tipos de corte que se describen en el
texto.

3.2.1 Ventajas y desventajas del mtodo de degradacin qumica.

diferentes tamaos que terminan en el mismo nucletido. Despus,

estos fragmentos se pueden separar en un gel de electroforesis con
cuatro carriles distintos, para determinar la secuencia del templado
(figura 6).

Figura 6. El mtodo de Sanger. Cuatro reacciones con ddNTPs diferentes permiten

la sntesis de distintos fragmentos con una terminacin especfica. Estos
fragmentos se pueden separar por electroforesis y comparando los tamaos, se
puede determinar la secuencia del templado.

El mtodo de Sanger tiene varias ventajas sobre el mtodo de MaxamGilbert (Blackburn y Gait, 1996). Las reacciones de secuenciacin del mtodo
enzimtico se pueden realizar en unas horas, en cambio las del mtodo de

recibida.

Figura 11. En la estrategia shotgun se secuencian fragmentos al azar y luego

usando un programa computacional se encuentran las regiones que se traslapan
para determinar la secuencia del fragmento original
(http://www.bioteach.ubc.ca/Bioinformatics/GenomeProjects/shotgun%201.gif).

En 1998 se fund la compaa de biotecnologa Celera Genomics, con el

propsito de completar el proyecto de secuenciacin del genoma humano
utilizando la estrategia shotgun (Myers, 1999). La validez de esta estrategia

EL FUTURO DE LA
SECUENCIACIN
Secuenciacin por hibridizacin
Secuenciacin a futuro sin
fragmentacin del ADN

Ciencias de la Tierra: modelos de ecosistemas

microbianos (procesos ambientales globales, cambio),
diversidad
Ciencias Biomdicas: aportaciones del microbioma
humano a la salud y enfermedad en poblaciones,
desarrollo de nuevos tratamientos
Energa: desarrollo de los sistemas y procesos
microbianos de nuevos recursos bioenergticos, ms
econmico, sostenible y resistente
Remediacin ambiental: herramientas para el control
de daos al medio ambiente en todos los niveles y
mtodos con base microbiana para la restauracin de la
salud del ecosistema (degradacin de contaminantes)
Biotecnologa:
identificacin
y
explotacin
de
capacidades biosintticas y biocatalticas de las
comunidades microbianas para generar beneficios en