Fcil manipulacin

Bajos costos de produccin

Rpido mejoramiento

Genoma secuenciado

Alto # de larvas/embriones

Danio rerio
Modelo biolgico por tener mucha similaridad en procesos fisilogicos de
mamferos.
70% genes proteicos y 84% genes relacionados a enfermedades humanas.
Es por eso que se le emplea bastante para realizar experimentos y estudios
sobre
enfermedades en humanos. (Lieschke & Currie, 2007)

Objetivo:

Evaluar los efectos de radiacin UV-B en hepatocitos de Zebra fish y analizar

que genes se expresan en el sistema de reparacin de DNA.

Conceptos y definiciones previos

P53: gen supresor, guardin del genoma. Activa Respuestas celulares ante
dao
DNA.
- Factor de transcripcin de componentes importantes involucrados en el
sistema reparacin de DNA.

Componentes del cycling arrest

CDK: Cycling-dependent kinase, protena que regula el ciclo celular, la

transcripcin, el procesamiento de RNAm.

Gadd45: Growth Area in DNA DAMAGE.

mamferos.

Cycling G1: detiene el ciclo celular en esta fase.

Sensores de estrs, clulas de

Apoptosis
Bcl-2 family: regulan la apoptosis o la supervivencia de la clula.

DNA Repair:

XPC: reconoce lesiones DNA. Codifica componentes del NER. (hlix-distorsing)

DDB2: Reconocimiento de lesiones en DNA producidas por UV-B. NER

Aplax1: Respuesta estrs oxidativo. BER. (a travs del ciclo celular), (non-hlixdis.)

 UV-A 400-315 nm

- Las R.U.V se clasifican en 3 categoras:

UV-B 315-200 nm
(Latonen & Laiho, 2005)

UV-C 200-100 nm

- Afectan organismos tanto acuticos como terrestres.

- Solo la radiacin UV-B lesiona al DNA.

- Este reaccin fotoqumica produce pyrimidines dimers formados en las bases

timina y citosina:

CPDs
bases en

inhiben polimerasas e interfieren en el apareamiento de

la

6-4,PPs

replicacin DNA.

- Si no se consigue reparar los daos en el DNA mutaciones, citotxicos,

carcinognicos. (Powell & Sweberg, 2005).

- Pasos del sistema reparador de DNA: (Begley & Samson, 2004)

1) Cycling Arrest

2) Activacin reparadores dna: XPC DDB2.

3) Revestir, remover o tolerar dao.

Materiales y
Mtodos
o

El linaje de hepatocitos de Danio rerio se compr en The American Type Culture

Collection.

Las clulas crecieron en frascos de plstico a 28C junto con suplementos

nutricionales y antimicoticos/antibacteriales al 1%.

Tratamiento

1) 24 pocillos de 1x(10)6 clulas c/u. durante 48h a 28C.

2) Se removi medio acuoso y se lavo con PBS.

3) La radiacin fue en un frasco de 1ml de PBS y diferentes intensidades.

Rango: (0 a 70 mJ cm-2.)

4) Distancia: 25 cm, Duracin: 5 a 6 dependiendo la dosis de radiacin.

5)Se removi el PBS y se le agreg de nuevo 1ml de PBS fresco.

6) Fase oscura por 24h a 28C.

7) De nuevo se removi el medio y se le agrego de nuevo 1ml PBS fresco junto

con trypsin-EDTA.

8) Determinacin clulas viables Trypsin Blue Exclusion

Anlisis

Se eligieron aquellos hepatocitos expuestos a (23mJ cm-2).

Anlisis por RT-PCR

El tiempo de radiacin de las clulas fue de 6, 12 y 24 horas.

Para cada grupo experimental, se usaron de 3 a 4 muestras para el aislamiento

de RNA.

Se cuantific usando QUBIT Quantitation Kit.

First-Strand cDNA fue sintetizado por 1ug de ARN. Luego se amplific mediante
PCR usando especficos genes primarios. (Tabla 1).

Luego se analizaron los productos por Electroforsis en gel de agarosa al 1%.

Por ultimo se aplico un ANOVA.

Tabla 1.

Resultados y Discusiones

La exposicin de los hepatocitos del pez cebra a diferentes dosis de radiacin

UV-B
redujo el numero de clulas viables al compararlo con el grupo control.

Las radiaciones mas bajas del experimento ( 11.6 . 17.5 mJ cm-2) no mostraron
significancia en sus clulas viables.

A diferencia de las de 23 mJ cm-2 que es la dosis donde se observa una

reduccin del 30% de sus hepatocitos.

Figure 1. Number of viable cells 24 and 48 h after exposure

to
different UV-B doses (0, 11.6, 17.5, 23.3, 35 and 70 mJ cm)2).
Values
are represented as percentage of control treatment. Equal
letters indicate absence of significant difference between
samples in the same time after UV-B exposure.

Al analizar las clulas al microscopio, se observa que los hepatocitos irradiados

de 35 a 70 mJ cm-2, muestran deformacin y alteraciones en su morfologa
celular.

En comparacin a otros dosis en otros estudios (como el Dong, et al.) que

trabajo en embriones de Danio rerio utilizo intensidades de hasta 930 mJ cm-2.

Figure 2. Effects of UV-B exposure on cell morphology. Cells were

exposed to 0, 23.3, 35 and 70 mJ cm)2 of UV-B (a, b, c and d,
respectively) and
analyzed under microscope after 24 h of exposure.

Basado en estos 2 primeros resultados, se decidi utilizar los hepatocitos

expuestos a dosis de 23.3 mJ cm-2 en el experimento de genes expresados en
los sistemas de reparacin de DNA.

Se elije esta intensidad de radiacin UV-B porque reducen en 30% las clulas
viables pero no se altera su morfologa visible.

El mayor dao causado por UV-B es a nivel de DNA, es por eso que existen
componentes que reducen estos efectos para una correcta replicacin del dna.

Estos componentes son evaluados en la figura numero 3.

p53 llave de activacin.

Figure 3. Kinetics of expression of some genes involved in

cell cycle
arrest (p53, CDKI, gadd45 and cyclinG1) after exposure to
23.3 mJ cm)2 UV-B. Values are relative to control group and
expressed as mean SE (n = 4). Significant difference
between control and cells exposed to UV-B at the same time is
indicated by an asterisk.

La principal respuesta ante este estmulo es la activacin de la p53.

El cyclin G1 es down-regulated 12h despus UV-B exposure. Sin embargo,
24h despus fue up-regulated.

El gadd45 fue up-regulated 24h despus.

El segundo estudio fue analizar que pasa con las clulas que no pueden ser
reparadas..

La apoptosis es la ruta ms prominente en la desactivacin celular. En su gran

mayora conlleva: - cambios cromosomticos
-mutaciones gnicas
- y transformaciones malignas.

Dentro de la familia de las Bcl-2 se encuentran 2 componentes relacionados

con el futuro de la clula afectada.

Bcl-2 anti-apoptosis

BAX pro-apoptosis

Lo interesante es que si en el orgaismo hay mas proporcin de una sobre otra,

esa ser la respuesta final que tomara sobre la celula, permitindola vivir o
matarla.

En la figura 4 se oserva que hay mas proporcin de BAX/Bcl-2.

Mientras que BAX se expresa normalmente, bcl-2 no se llega a expresar.

Figure 4. Effects of UV-B exposure on (a) expression of bcl-2

and bax
genes; and (b) ratio of bax to bcl-2 relative gene expression.
Values are
relative to control group and expressed as mean SE (n = 4).
Significant difference (P < 0.05) between control and cells
exposed to
UV-B at the same time is indicated by an asterisk.

Los componentes XPC y DDB2 estn involucrados en el reconocimiento de

lesiones inducidos por radiacin UV-B.
XPC 6-4,PPs

DDB2 CPDs

La produccin de ambos esta comandada por la p53 y en este caso, se

expresaron entre la 6 y 24h de expocision UV-B.

A las 6h se obtuvo el valor mas alto de produccin de DDB2.

Figure 5. Effects of UV-B exposure on expression of XPC and

DDB2
genes. Values are relative to control group and expressed as
mean SE (n = 4). Significant difference (P < 0.05) between
control
and cells exposed to UV-B at the same time is indicated by an
asterisk.

A parte de los CPDs y 6-4,PPs ; existen otro tipos de productos que daan al
DNA. El siguiente evaluacin quizo averiguar cuales eran lasnuevas rutas de
reconocimiento del dao de DNA.

Considerando esto se obtuvo:

Apex1

Up-regulated

Ogg1Nbsl

Down-regulated

ku80

Un-altered

Rad51

Figure 6. Effects of UV-B exposure on expression of DNA repair

genes (Rad51, Ku80, Nbs1, Apex 1 and Ogg1). Values are relative
to
control group and expressed as mean SE (n = 4). Significant
difference (P < 0.05) between control and cells exposed to UV-B
at
the same time is indicated by an asterisk.

Gracias a este tipo de investigacin en estos organismos en particular, se

pueden utilizar los resultos en forma de comparacin a otros mecanismos
observados en mamferos.

Es evidente el rol primordial de la p53 en este estudio como principal motor del
sistema celular de reparacin de DNA.

GRACIAS