VIGILANCIA DEL VIRUS

CHIKUNGUNYA POR
LABORATORIO EN
ARGENTINA

Bioq. Victoria Luppo

Laboratorio de Arbovirus
Instituto Nacional de Enfermedades Virales
Humanas (INEVH)
Dr. J.I.Maiztegui- ANLIS, Pergamino-Argentina

CHIKUNGUNYA
Virus del gnero Alphavirus y Flia
Togaviridae
Deriva de Makonde: aquel que se
encorva
Son esfricos, con
unanucleocpsidedentro
de unaenvoltura lipoproteica.
Son virus con genoma de RNA de
polaridad positiva de aprox. 11.5 KB
Genes protenas no estructurales:
replicacin del virus; genes de protenas
estructurales: implicadas en el
reconocimiento con el sistema inmune
(eptopes especficos)
Protenas no estructurales

Protenas estructurales

Est Relacionado Genticamente Y

Serolgicamente a Onyongnyong, Igbo Ora Y En Menor
Medida Mayaro Y Ross River
1 Serotipo
3 Genotipos Principales:
Africa Occidental (selvatico)
Africa Central/Este/Sur
(ECSA)
Asiatico-Americano

Seleccin, recoleccin y envo de

muestras

VIREMIA Y CINETICA DE
ANTICUERPOS EN
INFECCIONES POR CHIKV

DIAS DE EVOLUCIN

Tcnicas de laboratorio
para
CHIK
Aislamiento viral e
identificacin por IF o RTPCR

Deteccin de
genoma viral
(RT-PCR
convencional
y en Tiempo
Real )

Deteccin de anticuerpos contra

protenas virales: Elisa
IgM/IgG, Neutralizacin por
reduccin del nmero de

Inactivaci
n 1er
paso
extracci
n del RNA
(BSL2)

RT- PCR
CHIKV
Positivo

Algoritmo para deteccin de

CHIKV, DENV y
requerimientos de Bioseguridad
Muestra de Caso sospechoso
de CHIKV y DENV

Serologa
en casos
RT-PCR (-)
CHIK en
BSL2

< 8 das de evolucin

ELISA IgM
DENV (desde
4 dpi)

DENV y

Negativo

Positivo

Negativo
IgM CHIKV
Secuenciacin
Filogenia
Positivo

Aislamiento
Viral (BSL3)

Estudiar PAR
SEROLGICO por
Neutralizacin r tcnica
de para CHIK y otros
Alphavirus (BSL3)

Negativo

Solicita
Segunda
muestra
para
repetir
serologa

Estudiar por
tcnica de
neutralizaci
n para DEN y
otros
Flavivirus
(BSL2, virus
quimricos
para SLEV y
WN, cepa
vacunal YFV)

Algoritmo para deteccin de CHIKV, DENV y

requerimientos de Bioseguridad
Caso sospechos de DENV y
CHIKV

Serologa
en BSL2

8 das de evolucin

ELISA IgM DENV

y CHIK V

Positivo
CHIKV

Estudiar
PAR SEROLGICO
por tcnica de
neutralizacin
para CHIK y otros
Alphavirus
( BSL3)
*Estudio de segunda muestra para descartar
posible infeccin secundaria de DENV sin IgM
(Clnica y Epidemiologa)

Positivo
DENV

Estudiar
PAR SEROLGICO
por tcnica de
neutralizacin
para DENV y otros
Flavivirus
(BSL2, virus
quimricos para
SLEV y WN, cepa
vacunal YFV)

Negativo
DENV y CHIKV

Se descarta
caso de
DENV* o
CHIKV
Bsqueda de otros
Arbovirus

TCNICAS
DIRECTAS

AISLAMIENTO
VIRAL

Gold Stndard de los mtodos

directos

Muestra indicada: suero de fase

aguda
(< de 8 das de
evolucin y perfectamente
conservada)
Inoculacin en lineas celulares
suceptibles: BHK-21, HeLa, Vero y
C6/36. Efecto citoptico al 3er da.
Confirmacin por tcnica de IF , RTPCR convencional o en real time
del sobrenadante celular.
Aislamiento en laboratorio BSL3 de cepas obtenidas en el

Aislamiento de cepas de CHIKV en el

INEVH (BSL 3)

1. Se aislaron en celulas
Vero
2. Identificacin viral por
RT-PCR Real Time CHIKV
3. Titulacin por UFP
4. Secuenciacin de un
fragmento de Genoma
Viral y filogenia viral

Muestras de Suero de casos sospechosos

(< 8das de evolucin)

Se han obtenido
stocks virales con
titulos 10 7 ufp /ml:
cepa Asiatica
(aislamiento viral
de suero de un
viajero detectado
en Argentina)
Celulas Vero C 76

RT-PCR en tiempo
real CHIKV
Inicialmente se us un
protocolo diseado por el Dr.
Lanciotti 2007 (sensibilidad:
1UFP o 50 copias genmicas)
Diseo de sonda y primer en
base a la cepa prototipo S27
Detecta todos los genotipos
West Africa, ECSA y Asia
No hay reactividad para otros
Alphavirus (ONN, Ross River,
Mayaro, EEE, WEE, VEE,
Semiliki Forest, Sinbis).

RT-PCR en tiempo
real CHIKV
Recientemente se han diseado 2 sets de primers y
sonda ms especficos para el genotipo asitico
circulante (Fort Collins- CDC) (sin publicar an)
Se analizaron en el INEVH diluciones seriadas de una
de las cepas aisladas en el INEVH procedente de
Repblica Dominicana
Los sets 2 y 3 tienen mayor
sensibilidad que el set 1, por lo
cual se recomienda para el
anlisis de las cepas que
circulan actualmente en
Amrica
AAAAAAAAAAA

nsP1 nsP2 nsP3 nsP4 C E2 E1

No estructural

estructural

Sets de primer y sondas

Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
Set 2 (Asitico-Amrica)
3855F
3957c1,2
3996-FAM1,2
Set 3 (Asitico-Amrica)
856F
962c
908-FAM

RT-PCR convencional genrica para

Alphavirus
Oligonucletidos degenerados en la regin nsp4 (195pb)
Deteccin de EEE, WEE, VEE, CHIK, Ross River, Sinbis,
Semiliki Forest

Para identificar el Alphavirus se requiere la secuenciacin

genmica
AAAAAAA
nsP1 nsP2

nsP3 nsP4

No estructural

C E3 E2 E1
estructural

Caracterizacin Filogentica
de cepas circulantes
CHIKV detectado en
Argentina- INEVH 2014

Identificacin
del Genotipo
Asitico en
viajeros
procedentes del
Caribe

Anlisis bayesiano, 1200 nt

en la regin E ; 155 pb regin
nsp4. rboles de topologa
similar

Congreso Argentino de Vi
CAV,2015

TCNICAS
SEROLGICAS

ELISA de captura IgM CHIK (P/N)

Desde el 2011 el INEVH

cuenta con la tcnica de
Elisa IgM de captura
puesta a punto y
evaluada externamente a
travs de proficiencia del
CDC
Permite detectar
infeccin actual o
reciente
Presenta cruce serolgico
con otros alfavirus del
mismo grupo ej: virus
Mayaro, Ross River,
Onyong nyong)
Metodologa in house que

CHIK

RR

ONN

VEE

MAY

EEE

12.3

1.5

15.3

0.89

1.9

1.2

10.6

1.2

13.9

1.1

1.9

1.3

14.5

1.7

17.3

1.1

3.1

0.89

20.4

0.92

20.7

1.5

7.1

1.8

26.6

4.9

27.4

2.2

1.7

1.5

21.2

1.5

24.7

2.2

1.2

1.6

15.3

1.5

1.6

1.9

2.2

31.3

1.5

24.6

1.7

2.9

1.8

22

1.6

15.9

1.8

1.4

1.4

18.8

0.59

13.1

1.2

1.5

1.1

34.3

3.7

22.6

1.6

2.8

9.1

Fuente: CDC

1. Anti IgM humano (4C toda la noche)

2. Agregar suero de paciente en la dilucin adecuada

(37C , 1 Hora)

3. Agregar Antgeno (chik y normal para la misma muestra)

( 4C toda la noche)

4. Agregar el Ac monoclonal conjugado

con peroxidasa rbano (37, 1 Hora)
5. Adicin del Sustrato TMB. Dejar 30
min a 37C y solucin de Stop. Leer a
450 nm
Fuente: CDC

Inoculacin viral
Linea Celular
C6 / /BHK-21
36
VeroC76
Incubacin
x das, 34C

Monitoreo
por ECP y/o IFI

100 % Infeccin

Congelamiento -70C

Descongelamiento
Sonicado y centrifgado

ANTIGENO p/ ELISA IgM

Inactivacin por
irradiacin gamma

 Tcnica serolgica de
referencia para confirmar el
diagnstico
Aumento en 4 veces el
ttulo entre muestra
aguda/convalesciente.
Estudiar especificidad con
panel de Alphavirus
Se titul stock viral de
MAY para incorporar al
panel

INCORPORACIN DEL DIAGNSTICO DE CHIKV EN LA RED

NACIONAL DE LABORATORIOS PARA DIAGNOSTICO DE
DENGUE Y OTROS ARBOVIRUS

MUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIN!

Bioq. Victoria Luppo

vluppo@anlis.gov.ar
Dra Alejandra Morales
amorales@anlis.gov.ar
Lic Cintia Fabbri
cfabbri@anlis.gov.ar