OLGA LUCIA SAAVEDRA

YURI JIMENA JAIMES

MARA CAROLINA BRICEO
TOXICOLOGA
GRUPO 3A1

INTRODUCCION
Acetilcolinesterasa (AChE)

Constituyente
eritrocitos

de

los

Butirilcolinesterasa
(BChE)
o

Presente en el plasma

Hidroliza
por
lo
general
a
la
butiriltiocolina (BTC)

Hidroliza
a
acetiltiocolina (ATC)

la

Inhibida por un exceso

de sustrato

No es inhibida por un
exceso de sustrato

Sintetiza: medula sea

Sintetiza: hgado

El trmino colinesterasa
(ChE) hace referencia a una
serie de enzimas que bajo
ptimas condiciones
hidrolizan a los steres de la
colina.
Biomarcadores de exposicin
a pesticidas
organofosforados (OP) o a
agentes neurotxicos

INTRODUCCION
(I) Presencia tanto de AChE como de BChE en la sangre

Existe la necesidad de un
mtodo sencillo, rpido,
fiable y reproducible para
la determinacin de la
AChE y BChE en sangre
total.

(ii) Solapamiento del sustrato de estas enzimas Por

ejemplo la BchE, aunque es especfica para butirilcolina
(BTC), hidroliza la ATC
(iii) Presencia de AChE soluble en plasma
(iv) Presencia de la AChE en el plasma debido a la
hemlisis parcial o desprendimiento parcial de la AChE
de los eritrocitos durante la centrifugacin
(v) Interferencia por hemoglobina en la sangre

INTRODUCCION
La medicin de BChE en presencia
de AChE es ms fcil porque BChE
hidrliza BTC ms especficamente
que AChE, y hay compuestos de
nitrgeno
bis-cuaternario
especficos que inhiben la AChE .

La medida de AChE en presencia de

BChE es difcil porque la BChE
tambin hidroliza acetiltcolina, y no
se conoce un inhibidor para BChE
que no tenga accin sobre AChE.

Inhibidores selectivos de
BChE
o Tetraisopropyl
pyrophosphoramide
(IsoOMPA): tambin inhibe la
actividad de la AChE.
o Fenotiazina
o Etopropazina: inhibidor mas
selectivo. 20 m puede ser
usado
para
inhibir
completamente la BChE.

OBJETIVOS
Desarrollar y validar
un ensayo simple
para la
determinacin de la
actividad de ChE en
sangre total de
animales comunes
de experimentacin:
ratones, ratas,
cerdos de guinea,
minicerdos, perros y
primates no
humanos (verde
africano, cinomolgos
y monos Rhesus).

Determinar si la
actividad de AChE en
sangre total podra
ser determinada con
precisin en
presencia de
Etopropazina.

Determinar si un
inhibidor especifico
de AChE como la
Huperzina A era
necesaria para hacer
la determinacin
precisa de la
actividad de BChE en
sangre.

Determinar
la
dilucin ideal y la
mas baja de sangre
que es la adecuada
para
medir
la
actividad ChE en la
sangre total sin la
interferencia de la
hemoglobina.

METODOLOGIA
Muestras
Sangre de:
o

Ratones Balb/C

Ratas Sprague-Dawley

Perros Beagle

Monos

Cerdos de guinea,

Minipig

Humana

Las muestras fueron mezcladas con Tritn X-100

(0,03%) en agua hasta lograr diluciones entre 5
a160
Plasma y eritrocitos fueron separados por
centrifugacin 3000 revoluciones por 10 minutos a
4C.
o Lisados eritrocitarios diluidos en Tritn X-100
(1:39)
o Plasma fue usado o bien sin diluir o despus de la
dilucin en albmina srica bovina
o Lisados de sangre completa en Triton X-100
(1:19)

METODOLOGIA
Ensayo de Micro-Ellman para la medicin de la actividad de ChE

10 L de muestra fueron
agregadas por triplicado a
los pozos de una placa de
microtitulacin
que
contenan 240 L de Buffer
PB-DTNB

Se Incubaron a
22C
por
20
minutos

Determinar las tasas de hidrolisis de ATC y

BTC en las muestras diluidas de sangre

Se agregaron 50 de
L 6 mM de ATC o
BTC

Se ley a 412 nm
por 10 minutos

Una unidad (U) de actividad enzimtica

es definida como la cantidad que
hidroliza un micromol de sustrato en 1
minuto

METODOLOGIA
Valoracin de actividades de ChE en sangre con Etopropazina y Huperzina A
o 10 L de lisado
de sangre
o 30 L de PBDTNB

10
L
de
siete
diferentes soluciones
de
Etopropazina,
(concentraciones de
0,075 a 4,8 mM)

50 L de soluciones de
buffer/sustrato fueron agregadas
as:
o PB (columnas 1-3)
o 6 mM ATC (columna 4-6)
o 6 mM BTC (columnas 7-9)

Control:
10
L de agua

Se Incubaron a
22C
por
20
minutos

El mismo procedimiento
se hizo para valorar
plasma y lisados
eritrocitarios.
Huperzina A en rangos
de concentraciones de
125 nM a 8 M.

METODOLOGIA
Hidrolisis de BTC por AChE

o Se midi 0,25-8.0
U/ml de purificados
de Hu AchE y AChE
de
suero
fetal
bovino
,
usando
como sustrato la BTC,
para comprobar si la
AChes
hidrolizaba
dicho sustrato

Tambin se medio la
hidrolisis de BTC por Hu
AChE y AChE de suero fetal
bovino en presencia de 500
nM de huperzina A, con el
fin de saber si es factible
usarse para la medicin de
BChE

METODOLOGIA
Determinacin del contenido total de hemoglobina en la sangre

METODOLOGIA
Determinacin de la AChE y BChE en muestras de sangre enriquecida con
purificados Hu BChE

METODOLOGIA
Determinacin de la actividad de la AChE y BChE en muestras de sangre expuestas
a OP

RESULTADOS
Los datos sugieren que independientemente de la
fuente de sangre, la actividad de AChE puede ser
determinada con precisin en presencia de 20
microM de etopropazina usando ATC como
sustrato, y la actividad de BChE puede
determinarse usando BTC como sustrato en
ausencia de huperzina A