MTODOS

INMUNOLGICOS
Ana Carolina Pea Pachn
Jorge Enrique Gmez Rodrguez
Carolina del Pilar Garzn Hernndez
Sara Cancino Nio

CONTENIDO
Introduccin
Anticuerpos:
Qu son?
Cmo se elaboran?

Mtodos inmunolgicos:

Inmunodeteccin.
Inmunofluorescencia.
Inmunoprecipitacin.
Citometra de flujo.
Cromatografa de afinidad.
ELISA

INTRODUCCIN
Sustancias o eventos
incapaces de ser reconocidas
por mtodos normales.
Uso de la especificidad del
reconocimiento del
anticuerpo por su antgeno.
Desarrollo de mtodos ms
precisos y ms diversos.

ANTICUERPOS
Descripcin:
Inmunoglobulinas Reconocimiento.
Dos cadenas pesadas, dos ligeras.
Enlaces disulfuro.
Forma de Y Bisagra y fragmentos.
Sitio de unin: Eptope y partopo.

Tipos:
IgA
IgG
IgD
IgM
IgE

ELABORACIN DE ANTICUERPOS
Inoculacin en organismos modelo (Purificacin y
caracterizacin):
Rata, cabra, conejo, caballo.

Para produccin de anticuerpos monoclonales Transfeccin de lneas celulares (produccin en masa).

Diferencias entre anticuerpos monoclonales y
policlonales:
Los monoclonales son ms especficos. (Mejor respuesta)
Los monoclonales son ms homogneos. (Precisin)
Los policlonales se unen a varias partopes del antgeno.
(Muchas uniones)
Los policlonales salen del suero del animal. (Menos
rendimiento)

DESCRIPCIN GENERAL
DE LOS MTODOS
Tcnica

Descripcin

Aglutinacin

La relacin antgeno-anticuerpo se puede

cuantificar por el aglutinado formado.

Fluorescencia y citometra de flujo

El anticuerpo se marca con un

fluorocromo y se detecta por
fluorescencia emitida.

Radioinmunoensayo

El anticuerpo se une a un istopo

radioactivo.

Cromatografas de afinidad

Se puede utilizar para obtener

Anticuerpos o Antgenos puros.

Inmunoprecipitacin e inmunoblotting

Detecta presencia y cantidad de

antgenos o anticuerpos especficos.

INMUNODETECCIN
PRINCIPIOS BSICOS
Uso de anticuerpos para identificar
protenas especficas como antgenos o
ADN.
Depende del tipo de anticuerpo
Funcin: Determinacin de la cantidad
de este y de su antgeno
Afinidad y avidad

PROCEDIMIENTO GENERAL INMUNODETECCIN

INMUNOPRECIPITACIN
Agregacin progresiva de antgeno a
una solucin de anticuerpos para
formar agregados de redes
tridimensionales.
Ventajas: No desnaturaliza las
protenas - Permite estudiar
anticuerpos dirigidos contra
eptopes conformacionales.
Tipos:
Tcnica de Ouchterlony
Inmunoelectroforesis
Tcnica de difusin radial de Mancini.

INMUNODIFUSIN
DE OUCHTERLONY
Placas de agar donde hay pocillos: Muestra y
anticuerpo.
Por difusin, las soluciones se encuentran y el
complejo antgeno-anticuerpo precipitar.
Demora de 18 a 20 horas.
Desventajas: Efecto Prozona.
Ventajas:
Sensibilidad <1mg.
Permite identificar la existencia de determinantes
comunes en Anticuerpos de diferentes especies.

INMUNOELECTROFORESI
S
Combinacin de reacciones antgenoanticuerpo con un campo elctrico.
Dos fases: Aislamiento del anticuerpo
por electroforesis y reaccin con el
antgeno.
Por difusin, los componentes se
encuentran y reaccionan formando
una lnea de precipitacin.
Usos: Identificar protenas del
mieloma.

DIFUSIN RADIAL DE MANCINI

Gel con anticuerpo incorporado.
En el pocillo se coloca la muestra a estudiar.
Por difusin, se formar un anillo de
precipitacin de acuerdo al gradiente de
concentracin de antgeno en la muestra.
Ventajas: Mtodo de alta precisin.
Desventajas:
Tiempo (48-72 h).
Concentraciones altas de muestra.

INMUNOFLUORESCENCIA
PRINCIPIOS BSICOS
Fluorescencia: Propiedad de ciertas
molculas que al ser irradiadas con una
longitud de onda adecuada, emiten una
radiacin de longitud de onda
caracterstica (color) - Cuantificacin.
Principio funcional: Absorber energa de
mayor longitud y emitir una de menor
longitud.
Cada fluorocromo tiene un espectro de
excitacin y de emisin caracterstico.
Desventajas: Disponibilidad de filtros
en el microscopio.

INMUNOFLUPORESCENCIA
Reaccin antgeno-anticuerpo unido a un
fluorforo que luego es excitado por luz
UV.
Usos: Observar la distribucin especifica
de algunos antgenos o secuencias
especificas de ADN.
Ventajas: Muestras frescas o fijadas.

DIRECTA VS.
INDIRECTA
Mas rpida

Pasos adicionales debido

al uso de un segundo
grupo de ANT.

Ms caros sobretodo si
vas a usar ms de uno.

Ms baratos si usas el
mismo anticuerpo
secundario para los
ensayos.

Menos complejo

Hay que tener cuidado

con el tipo de anticuerpo
secundario usado

No estn fcilmente
disponibles

Son mucho mas fciles de

conseguir

Reactividad cruzada en
mnimo

Es mayor debido a que

son mas pasos

ANLISIS
INMUNOFLUORIMTRIC
O

LIMITACIONES DE LA
INMUNOFLUORESCENCIA
Photobleaching
Descomposicin del
fluorforo.
Autofluorescencia
Fluorescencia de
coenzimas.
Sobrelape de fluorescencia
Interferencia de la
longitud de emisin.

CITOMETRA DE FLUJO CITMETRO

A: Fuente emisora de luz lser L1: Lente colimador L2: Lente
enfocador C: cmara de flujo laminar s: Pantalla para
detener la luz que atraviesa a C. L3: Lente que enfoca la luz
dispersada en D1. D1: Fotodiodo.
L3 +D1: FSC Detector de dispersin frontal (Volumen de
partcula)
L4: Lente que enfoca la luz hacia M. M: Espejo dicroico
(refleja la luz de igual longitud que la que emite A) F1: Filtro
que incide sobre SSC.
SSC: Detector de dispersin lateral (Complejidad de la
clula)
F2: Filtro interferencial que capta la luz de longitud diferente
a la de A. (Se puede ajustar) D3: Tubo fotomultiplicador.
F2 + D3: SFL Detector lateral de fluorescencia.

FUNCIONAMIENTO DE UN
CITMETRO

CITOMETRA DE
FLUJO (FACS)
Separacin de clulas suspendidas debido a la
fluorescencia que emite el fluorocromo cuando
es excitado.
El fluorocromo se encuentra unido qumicamente
al anticuerpo Separacin especfica.
Ventajas:
Anlisis de clulas vivas.
Blancos en la superficie y en el interior de la
clula.
Separacin por carga y otras caractersticas como
tamao y complejidad
Gran nmero de clulas analizadas.

ANLISIS DE DATOS DE LA
FACS
Dot plot: Un
parmetro vs otro.
Los datos se
encuentran muy
saturados.

Density plot: Un
parmetro vs otro,
los colores
diferentes
representan
subpoblaciones.

Contouring plot: Un
parmetro vs otro, sirve
para separar mejor las
poblaciones. Algunos
muestran las clulas que
no entran en ninguna
poblacin.
Histogram plot: Un
parmetro es
mostrado. El eje X es
la frecuencia y el eje Y
es la intensidad de la
fluorescencia.

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
La columna se empaca con el antgeno
para el analito que se quiere aislar.
Se pasa la muestra y se lava el
excedente
Se eluye la columna con buffers
(alteracin del pH).
Se separa por fracciones.

TEST
ELISA
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay o ensayo
por inmunoadsorcin ligado a enzimas.
Principio: Un antgeno inmovilizado se detecta
mediante un anticuerpo enlazado a una enzima
capaz de generar un producto detectable.
Usos: Medicin de hormonas, antgenos de la
hepatitis y sustancias que se encuentran a muy
bajas concentraciones.

TIPOS DE ENSAYOS
ELISA

Directa

Indirecta

CARACTERSTICAS DE ELISA
Uso de controles:
Positivo: En el que se sabe con certeza
que el antgeno est presente.
Negativo: Muestra del mismo tipo de la
muestra a analizar (sangre, orina, por
ejemplo) de las que se tenga certeza de
la ausencia del antgeno

Enzimas de uso comn: Peroxidasa,

galactosidasa o glucosa oxidasa.
Espectrofotometra (414nm)

ALCANCES Y LIMITACIONES ELISA

Si bien es muy sensible, si no se realiza
adecuadamente, es decir, si no se
controlan bien las condiciones de montaje,
puede arrojar resultados errneos.

Estos pueden ser

Falsos positivos:
Errores en la unin de los antgenos o de los
anticuerpos al pocillo.
Uso de mucho antgeno.
Muestra obtenida de una persona que se
est recuperando de una enfermedad.

Falsos negativos:

Uso de poco antgeno

Muestra muy diluida
Inespecificidad antgeno
anticuerpo
Baja cantidad de
anticuerpos
Ventana inmunolgica
Cepas extraas

BIBLIOGRAFA Y REFERENCIAS

Inmunoqumica. Prof. Roco Vanessa Caldern. Instituto de biotecnologa. UNAM. Cuernavaca, Morelos. 2007. Disponible en:
<http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf>

Curso de inmunologa general: 5. Inmunoglobulinas y otras molculas de clulas B. Prof. Enrique Iez Pareja. Departamento de
microbiologa. Universidad de Granada. Espaa. Disponible en: <https://www.ugr.es/~eianez/inmuno/cap_05.htm>

Anticuerpos policlonales. Gisela Balderas. Universidad Autnoma Metropolitana. Disponible en:

<http://es.slideshare.net/fotomascota/anticuerpos-policlonales>

Tratamiento de induccin con timoglobulina en el trasplante renal, evolucin a 10 aos. Margarita Delgado Crdova. Facultad de
Medicina. Universidad Complutense de Madrid. Espaa. Disponible en: <http://eprints.sim.ucm.es/21257/1/T34446.pdf>

The Use of Flow Cytometric DNA Ploidy Analysis of Liver Biopsies in Liver Cirrhosis and Hepatocellular Carcinoma. Ashraf Tabll and
Hisham Ismail.

Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Leonore A Herzenberg, James Tung, Wayne A Moore, Leonard A Herzenberg
& David R Parks.

Introduction to flow cytometry. Rich Hastings. KU Medical Center. Kansas, EE.UU. Disponible en:
<http://www.slideshare.net/richardhastings589/kumc-introduction-to-flow-cytometry>

Cromatografa (Parte II). Ermenegildo Mauricio, Graciela Escandar. SlidePlayer. Disponible en: <http://slideplayer.es/slide/154856/>

BIBLIOTECA DE IMGENES
1.

Fluorescence Microscopy. Leica Microsystems. Disponible en: <http://www.leica-microsystems.com/applications/lifescience/fluorescence/>

2.

Anticuerpos. Muy interesante. Disponible en: <http://www.muyinteresante.es/tag/anticuerpos>

3.

Inmunologa Draconis. Disponible en: <http://inmuno-draconis.blogspot.com.co/>

4.

Anticuerpos. Wikipedia. Disponible en: <https://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpo>

5.

Antigenos & anticuerpos. Mindomo. Disponible en: <https://www.mindomo.com/es/mindmap/antigenos-anticuerpos6c58125d4a824b8b8ad2401d5e28e580>

6.

Inmunoqumica. Instituto de biotecnologa. UNAM. Disponible en: <http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf>

7.

Tratamiento de induccin con timoglobulina en el trasplante renal, evolucin a 10 aos. Margarita Delgado Crdova. Facultad de
Medicina. Universidad Complutense de Madrid. Espaa. Disponible en: <http://eprints.sim.ucm.es/21257/1/T34446.pdf>

8.

The Use of Flow Cytometric DNA Ploidy Analysis of Liver Biopsies in Liver Cirrhosis and Hepatocellular Carcinoma. Ashraf Tabll and
Hisham Ismail.