Biologa Molecular

aplicada a
Inmunohematologa
Patricia Peralta Moncada
Universidad de Chile

Temas a tratar
Introduccin.
Utilidades de las tcnicas moleculares en

inmunohematologa.
Tcnicas utilizadas.
Revisin rpida de un trabajo de investigacin.
Conclusiones.

Introduccin
La hemaglutinacin ha permitido el desarrollo y la prctica de la
medicina transfusional durante el siglo XX.
La reaccin entre los antgenos eritrocitarios y los anticuerpos (suero de
pacientes o reactivos comerciales) es la base de las tcnicas en
inmunohematologa:
Determinacin de grupo ABO, Rh.
Determinacin de antgenos de significancia clnica (Kell, MNS, Kidd,
Duffy)
Deteccin de anticuerpos irregulares.
Pruebas de compatibilidad.
Limitaciones:
Fenotipo de pacientes politransfundidos.
Fenotipo de pacientes con GR recubiertos de Ig.
Identificacin de variantes.
Discrepancias.
Falta de reactivos para deteccin de algunos antgenos.

Introduccin
Las tcnicas que involucran al ADN han llevado a entender las
bases moleculares de muchos de los sistemas sanguneos.
Existen muchos eventos moleculares que llevan a la formacin de
antgenos distintos, y por ende, fenotipos distintos.
La mayora son consecuencia de SNPs (single-nucleotide
polymorphism).
Eventos moleculares que llevan a antgenos y fenotipos de los
grupos sanguneos
Conversin gentica o eventos de recombinacin (MNSs, Rh, Ch/Rg)
Duplicacin de un exn (Gerbich)
Delecin de un gen, exn o nucletidos (ABO, Rh, MNS, Kel, Duffy,
Dombrock)
Insercin de nucletido (s) (Rh, Colton)
Sustituciones de un solo nucletido SNPs (La mayora)

Las tcnicas moleculares aprovechan esto para la

Genotipificacin

Utilidades
Pacientes con transfusiones mltiples
Como complemento a la investigacin serolgica.
Se recomienda la genotipificacin en pacientes con
mltiples transfusiones como parte del proceso de
identificacin de anticuerpos.
Particularmente til en pacientes dependientes de
transfusiones que han producido aloanticuerpos.
Pacientes con GR recubiertos de IgG
(AHAI)
No pueden ser fenotipificados de manera exacta la
mayora de las veces.
Mejorara la posibilidad de encontrar unidades
compatibles.

Utilidades
Donantes
Para posibles transfusiones de la unidad (bsqueda de unidades
antgeno negativos).
Para crear paneles de clulas para bsqueda de anticuerpos
irregulares.
Resolucin de discrepancias
D dbil y parcial
Discrepancias ABO
Materno-fetal
Para prevencin de EHRN (por incompatibilidad Rh).
DNA fetal se puede obtener a partir de clulas amniticas,
muestras de vellosidades corinicas y de plasma materno.

Tcnicas moleculares para el anlisis gentico de

grupos sanguneos.

Amplificacin de ADN por PCR

PCR-alelo-especifico
PCR-RFLP
PCR-multiplex

Secuenciacin
Real time PCR
Microarray
Complementarias o independientes.

PCR convencional
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction).
3 procesos que se repiten por cada ciclo:
1. Denaturacin
2. Apareamiento
3. Extensin

Basado en las caractersticas de los cidos nucleicos:

1. Mimetiza el proceso de replicacin del ADN.

2. Capacidad de separarse (denaturacin) y volver a hibridarse (renaturacin).
3. Complementariedad de bases (A=T; G=C).

Equipo: Termociclador.
Deteccin: Electroforesis en gel de agarosa con tincin (Bromuro
de etidio, GelRed)

PCR convencional

PCR Alelo Especfico

Uso de partidores secuencia especfica.
Permite la identificacin de secuencias especficas para
identificar distintos alelos de un gen.

Mixes de reaccin
pre-alicuotados
basados en PCR Sequence Specific
Primers (SSP).
Genotipificacin
rpida.
Complemento a
tipificacin serolgica.

PCR-RFLP
RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphysm.
Tratamiento del DNA amplificado por PCR o tratamiento del

DNA a amplificar con enzimas de restriccin para generar

cortes en secuencias especficas.
Se obtiene un patrn de bandeo dependiendo de los cortes
realizados por las enzimas.

Ejemplo: How do we identify RHD variants using a practical molecular approach?

Fenotipo D

Polimorfismo relacionado

D dbil tipo 1

809T>G; ApaLI

D dbil tipo 2

1154G>C; AluI

D dbil tipo 3

8C>G; SacI

DAR-1

957G>A; BseYI

PCR-multiplex
Amplificacin

de la muestra de
ADN utilizando varios sets de
primers a la vez, en un mismo mix
de reaccin, que son especficos
para diferentes regiones de la
secuencias de ADN.
Para
la
deteccin
por
electroforesis, se debe tener en
cuenta el diseo de los partidores
para
obtener
productos
de
diferentes tamaos.

High-throughput multiplex PCR genotyping for 35 red

blood cell antigens in blood donors

Real Time PCR

Variante de la PCR convencional en la cual se puede

cuantificar el producto simultneamente a su amplificacin

(Deteccin en tiempo real del producto).
Se distinguen entre s por el mtodo de deteccin:

Fluorocromo no especfico:

SYBR Green (se une a cualquier molcula de ADN).

Fluorocromo especfico (sonda):

Sondas TaqMan
Sondas Molecular Beacons
Sondas Scorpion

Se cuantifica la fluorescencia emitida

Real Time PCR

CT: Ciclo Umbral

(Threshold cycle): N
de ciclo donde la seal
cruza el umbral de

Secuenciacin
Tcnica mediante la cual se

logra conocer la secuencia

nucleotdica de la porcin de
ADN a analizar.
La gran mayora est basado
en el mtodo de Sanger y
Rapley.

Cundo
secuenciar?
Serologa

Genotipificaci
n

Secuenciacin

Microarrays
Chip de DNA: Son una coleccin de sets de fragmentos de ADN

adheridas de forma ordenada a una superficie slida.

Para genotipificar mltiples regiones del genoma
simultneamente.
Se basa en la capacidad de los cidos nucleicos de hibridar con
su complementario.
Deteccin: marcaje de la muestra con fluorocromos, plata o
quimioluminiscencia.
Anlisis de datos: bioinformtica. Softwares especializados para
cada chip con bases de datos para generar los genotipos.

Microarrays
En una misma prueba genera sobre 3000 resultados.
Se basa en la deteccin de SNPs.
El DNA genmico target aislado de sangre total se amplifica, se captura y se

marca con fluorescencia por elongacin en sondas alelo especficas

inmovilizadas en micropartculas sintticas. La fluorescencia de cada perla
se analiza en el Array Imaging System (AIS). El software BioArray Solutions
Information System (BASIS) calcula y ajusta la intensidad de cada reaccin
para asignar un genotipo y predecir un fenotipo para cada polimorfismo.

Microarrays

How do we identify RHD

variants using a practical
molecular approach?
Revista Transfusion, volumen 54, Abril
de 2014.

How do we identify RHD variants using a

Revista Transfusion,
practical molecular approach?

volumen 54, Abril de

2014.

Importancia:
Prevenir la aloinmunizacin en receptores.
Receptor D
parcial

Tipificado
Rh+
(Sueros
clasificador
es)

Transfusin
con Rh+

Formacin
de anti-D

Donante D
dbil

Tipificado
Rh- (Sueros
clasificador
es)

Transfundid
oa
receptor
Rh-

Formacin
de anti-D

How do we identify RHD variants using a

practical molecular approach?
Estrategia: Mtodo fcil y racional para la identificacin de las variantes D ms
comunes usando un camino ms corto y menos caro en comparacin a otros
mtodos moleculares comerciales.
Algoritmo basado en la gentica molecular de RHD, polimorfismos de D, frecuencias
de las D variantes en diferentes poblaciones y asociacin con los alelos RHCE.
(Bsqueda en bases de datos ISBT y Rhesus Site)

360 muestras con expresin atpica del antgeno D (Reactividad menor de

3+ en la tipificacin D).
PCR multiplex basado en Genotyping of RHD by multiplex polymerase
chain reaction analysis of six RHD-specific exons (Maaskant-van Wijk y cols.)

Seis sets de primers especficos para la amplificacin de los exones 3, 4, 5, 6, 7 y 9 del

gen RHD. Adaptacin: 5 sets que amplifican los exons 3, 4, 5, 7 y 9

Localizados en las regiones donde se pueden encontrar SNPs causantes de muchos D

variantes.

Basado en los resultados, combinados con la asociacin a los alelos RHCE y

las frecuencias de las variantes, se decide el protocolo a utilizar.

How do we identify RHD variants using a

practical molecular approach?

1. PCR

multiplex
2. PCR-RFLP
3. Secuenciaci
n
de DNA

How do we identify RHD variants using a

practical molecular approach?

How do we identify RHD variants using a

practical molecular approach?
84 muestras (23% ).
PCR multiplex + 1 PCR-RFLP
135 muestras (37%).
PCR multiplex + 2 PCR-RFLP
PCR multiplex + 3 o ms PCR-RFLP + secuenciacin de un
exn

121 muestras (33%).

Ventajas:
PCR multiplex + PCR-RFLP toman aproximadamente 2 horas (corto
tiempo).
Ms barato que microarrays o secuenciar los 10 exones.
Identificacin de variantes no cubiertas en microarrays (11,6% de las
muestras estudiadas).
til para resolver discrepancias RhD y distinguir entre D dbil o parcial.
Puede ser adaptado a otras poblaciones.

Conclusiones
La existencia de las tcnicas moleculares facilita la resolucin
de problemas que no pueden ser resueltos con la
hemaglutinacin.

Reactividad dbil de algunos reactivos para ciertos antgenos.

Tipificacin de pacientes con transfusiones recientes.
Identificacin de riesgo de EHRN.
Aumentar la fiabilidad de unidades antgeno negativos para
transfusin.

Llegar a un genotipo no significa necesariamente que el

antgeno se va a expresar en el GR.

La mayora de estas tcnicas son muy costosas, por lo cual el
enfoque que se est dando en los estudios es la creacin de
algoritmos de identificacin para disminuir costos,
manteniendo la calidad.

Bibliografa

Mariza Mota,MD,PhD. Hospital Israelita Albert Einstein So Paulo, Brasil. 06 y 07 /10 /2011.
Jornada de Hematologia y Medicina Transfusional de la Sociedad Chilena de Hematologia.
ACTUALIZACIN EN INMUHEMATOLOGIA: NUEVAS TCNICAS DIAGNSTICAS. Extrado de
http://www.hematologia.org/bases/arch889.pdf
http://www.bag-healthcare.com/uploads/media/BAG_Broschuere_v_BAGene-01eng.pdf
ARUP Laboratories. Blood Group Microarray, Nine Blood Groups For genotyping the ABO,
RhD/RhCE, Duffy, Kell, Kidd, Diego, Dombrock, Colton, and MNS blood groups. FEBRUARY
2010.
Secuenciacin
de
ADN.
Extrado
de:
http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm#
Metautomatico
Axel SeltsamandAndrea Doescher. Transfus Med Hemother. Sequence-Based Typing of
Human Blood Groups. Jun 2009; 36(3): 204212. Published online May 14,
2009.doi:10.1159/000217322.
Extrado
de
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2980529/
BioArrayTM HEA BeadChipTM. Extended Red Blood Cell Antigen Typing by DNA Analysis.
Extrado
de
http://www.immucor.com/enus/Products/Documents/BioArray_HEA_SalesSheet.pdf
Castilho Lilian, Pellegrino Jnior Jordo. Blood group genotyping. Rev. Bras. Hematol.
Hemoter. [serial on the Internet]. 2004 [cited 2014 Sep 15] ; 26( 2 ): 135-140. Disponible
en:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S151684842004000200012&lng=en. http://dx.doi.org/10.1590/S1516-84842004000200012.

Biologa Molecular
aplicada a
Inmunohematologa
Patricia Peralta Moncada
Universidad de Chile