Columnas de HPLC

SON DE :
Acero inoxidable ( aunque tambin pueden ser de polmeros o vidrio).

Columnas analticas
En general:
1.-longitud de entre 5 y 25
cm
2.- dimetros internos de 3
a 5 m o tambin de 2 a 60
mm.
tamao de partcula:
para los empacamientos es
de 3 a 5 m

Las columnas ms utilizadas:

1.-10 a 15 cm de largo
2.- 4.6 mm de dimetro interno
3.-empacadas con partculas de 5
m

precolumnas
Se utilizan dos tipos de precolumnas:
1.-Se utiliza una precolumna entre el reservorio de fase
mvil y el inyector.
-acondiciona la fase mvil
-El disolvente se disuelve parcialmente en el
empacamiento de slice
-asegura que la fase mvil se sature con cido silcico
antes de entrar a la columna analtica

precolumnas
- minimiza las perdidas de relleno
- su composicin debe ser similar a las de la columna ,
aunque el tamao de partcula es mayor al de la columna
para minimizar la cada de presin.

2.- precolumna de proteccin

- posicionada entre el inyector y la columna analtica.
- es una columna corta empacada con una fase estacionaria
similar a la de la columna analtica.
- previene que impurezas como los compuestos altamente
retenidos y la materia particulada alcancen y contaminen a la
columna analtica.
- sirve para incrementar la vida media de la columna analtica

1.- la columna contiene una fase estacionaria, en su

mayora de slice que puede realizar ciertas funciones
como:
-superficie absorbente: los grupos activos de la superficie
de la slice o tambin llamados grupos silanol, son
responsables de la separacin.

-actuacin como substrato microporoso: la slice permite la

seleccin de molculas en funcin de su tamao

TIPOS DE
COLUMNA

PARTICIO
N

REVERSA
NORMAL

ABSORCI
N
INTERCAMBIO
IONICO
EXCLUSION
AFINIDAD

COMPOSICIO
N DE FASE
DIFERENTE

TIPOSDERELLENODELACOLUMNA
El relleno puede ser de dos tipos de partculas porosas o
pediculares
Los rellenos de partculas porosas para HPLC
estn formados por micro partculas porosas
con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor
dispersin
posible
para
un
tamao
determinado. La slice es el material ms
comnmente empleado para este tipo de
columnas, debido a que se pueden producir
partculas con dimetros muy uniformes
El relleno pedicular consiste en bolas de vidrio o de
polmero, no porosas y esfricas con unos
dimetros caractersticos de 30 a 40 m. En la
superficie de estas bolas se deposita una capa
delgada de slice.
El rellenopedicularseutilizaampliamenteenpre
columnasynoparacolumnasanalticas

Partculas
porosas

TAMAO DE PARTICULA: 3-10 m

Tienen un recubrimiento com pelculas
orgnicas unidas fsica o quimicamente

Columna HPLC de Particin:

Fase normal:
-se trabaja con fase
estacionaria polar y fase
mvil no polar
-se utiliza cuando el
compuesto de inters es
bastante polar

Fase reversa:
Cuando se emplea una
fase estacionaria no polar
y fase mvil polar.

HPLC NORMAL

FASE
ESTACIONARIA(P
OLAR)
slice o almina
( absorbentes de
slice esfrico

FASE
ANALITOS (POLAR)
MOVIL(APOLAR)
Hexano , cloroformo, cianos y aminos.
acetato de etilo,
cloruro de
metileno, etc.

Relleno/empaquetado:

tiles para la retencin y -relleno solido absorbente de slice o almina

la separacin de hidratos -La fase estacionaria tiene un tamao de
partcula entre 3 y 10 m. Aunque comnmente
de carbono.
es de 3 a 5 m
-forma esfrica
-tamao de poro se mide en A

HPLC INVERSA/ REVERSA

FASE ESTACIONARIA
(APOLAR)
-Cadenas hidrocarbonadas o
grupos fenilo
-slice tratada con otros
grupos funcionales como el
octadecilo, cianilo, fenilo,
butilo entre otros.

FASE MOVIL( POLAR)

Agua y acetonitrilo, en
donde el agua es utilizado
en grandes proporciones
con un modificador
orgnico que completa la
composicin del eluyente

ANALITOS
(APOLAR)
para compuestos
como dimetilsililo,
fenilsililo,
octametilsililo, etc.

las aplicaciones de los mtodos de fase inversa se utilizan para preservativos

alimentarios, herbicidas y azcares.

Relleno/empaquetado:

-Relleno es liquido y de dos tipos, uno es una matriz de gel de slice

con cadenas alquilo unidos qumicamente y el otro es base de
resina.( la segunda se utiliza en caso de que el pH de la primera no
es apropiado.
-cuanto mas larga es la cadena alquilo mayor es la fuerza de
retencin.
-el tamao de fase estacionaria con un poro de 30 nm.
- Forma esfrica
- Tamao de partcula es de 5m y 6 para en ocasiones hasta 10 nm

HPLC ADSORCIN:
FASE
ESTACIONARIA

FASE
MOVIL

ANALITOS

Silica al 90% y alumina

al 10% y carbonato
clcico.

disolvente
apolar (nhexano)
unido a otro
ms activo
(acetona,
cloruro de
metilo, etc.)

para
compuestos
como
dimetilsililo,
fenilsililo,
octametilsililo,
etc.

separacin de compuestos orgnicos neutros (mezclas).

se utiliza en el laboratorio clnico para la separacin de 17-cetoteroides, 17hidroxicorticoides, catecolaminas y otras sustancias urinarias.
para compuestos no polares con masas inferiores a 5000.

-Se utiliza para molculas no ionizantes o no solubles en agua.

-su fase estacionaria es la superficie de un slido finamente dividido

Columna HPLC de exclusin/permeacin

de gel
-Se basa en la diferencia de tamaos FASE
ESTACIONARIA
de molculas a separar
La fase
estacionaria es
un liquido o
partculas
nanoporosas
(geles de
dextrano y
slice).
-largos polmeros
entrecruzados
que forman una
red
tridimensional
porosa

FASE
MOVIL

ANALITO
S

Agua,
cloroform
o,
alcoholes,
hexano,
isopropan
ol

Separaci
n
de
compuesto
s
biolgicos
como
protenas
y pptidos.
polmero
s