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trasplante renal:
deteccin y significado
Massari, Pablo
Castellano, Mauro
Carrera de Posgrado en Nefrologa UCC
Servicio de Nefrologa y Programa de Trasplantes Renales
Hospital Privado-Centro Mdico de Crdoba
12 de Mayo de 2011
Definicin
Clases HLA
Respuesta inmunologica
INTRODUCCION
Complejo Mayor de
histocompatibilidad (MHC):
Regin heterognea y polimorfa del
brazo corto del cromosoma 6 (6p21.3).
Codifica molculas de superficie celular
(HLA).
Herencia mendeliana codominante.
Dividido en 3 regiones:
Clase I
HLA A, B y C.
Expresadas en casi todas las clulas nucleadas del
organismo (Ausente en eritrocitos y trofoblastos).
Formados por una cadena pesada () codificada
en el HLA y una cadena liviana () codificada en el
Cr 15.
Tambin contiene HLA-E, HLA-F y HLA-G
(Molculas MHC no Clsicas).
Unen pptidos derivados del citoplasma.
Presentan antgenos peptdicos a linfocitos T
CD8+ induciendo apoptosis o liberacin de
citotoxinas.
Clase I
(Molculas MHC no Clsicas)
Limitado Polimorfismo.
Baja expresin en la superficie celular.
Distribucin celular y tisular muy selectiva.
Son reconocidas por receptores NK (RNK).
HLA G :
expresado en trofoblasto fetal y clulas epitelio tmico.
Se une a ILT-2, ILT4, KIR2DL ( - ) lisis por NK y LT.
Induccin de tolerancia materno-fetal.
Vigilancia del sistema inmune frente a tumores.
HLA E :
Se une a CD94/NKG2A que ( - ) actividad NK y de ciertos LT.
HLA F :
Se expresa en amgdalas, bazo y timo.
Se unen a LIR 1 y LIR 2 e inhiben linfocitos
Clase II:
HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP.
Expresados constitutivamente en clulas B,
clulas dendrticas y monocitos. Pueden ser
expresados en otras clulas durante la
inflamacin (citoquinas: IL-2 y IFN-gamma).
Constituidas por una cadena pesada () y una
cadena liviana () ambas codificadas en el MHC.
Unen pptidos derivados de protenas
extracelulares.
Presentan antgenos a Linfocitos T CD4+.
Clase III
No contiene ningun gen del HLA, pero
codifica genes de importancia en la
respuesta inmune:
Complemento (C2, C4 y factor B).
Factor de Necrosis tumoral.
Heat shock protein.
TCNICAS DE DETECCIN
DE ANTICUERPOS ANTIHLA
Crossmatch (XM)
Busca anticuerpos anti-HLA en el suero
del receptor que reaccionen con los
Antgenos HLA del donante.
Suero del receptor + Clulas del donante
XM + : Presencia de anticuerpos en el suero
del receptor dirigidos contra las clulas del
donante contraindica el trasplante.
XM - : Ausencia de anticuerpos en el suero
del receptor dirigidos contra las clulas del
donante
permite el trasplante.
Crossmatch (XM)
Objetivos:
Detectar Anticuerpos
Identificar Especificidad
Mtodos:
CDC (Citotoxicidad Dependiente
Complemento)
ELISA
Citometra de Flujo
Luminex
Crossmatch (XM)
Variantes:
Contra panel PRA (Panel Reactive
Antibodies) pre y post trasplante.
CDC, ELISA, CF, LUMINEX
Fuerza
Especificidad
Sensibilidad en deteccin de
Anticuerpos anti-HLA
METODOS
Citotoxicidad dependiente de
C (CDC)
Reaccin antgeno-anticuerpo con fijacin de
complemento y visualizacin de la reaccin con un
colorante.
Se pueden utilizar clulas (linfocitos T y/o B) aislados
de sangre perifrica, ganglio linftico o bazo
La reaccin se cuantifica segn el porcentaje de
clulas muertas.
Este es el mtodo de referencia clsico.
Prueba cruzada pretrasplante positiva frente a
clulas T contraindica el trasplante (Patel y Terasaki
1969).
La significacin de un resultado positivo con clulas
B mediante la misma tcnica no contraindica el
trasplante en todos los casos. (Stites y cols., 1997).
Citotoxicidad dependiente de
C (CDC)
Citotoxicidad dependiente de
C (CDC)
Reaccin CDC
Citotoxicidad dependiente de
C (CDC)
Score de las reacciones de CDC
% cel
muertas
Valor
asignado
0 10
11 20
21 -50
51 80
80 100
Unreadable
1
2
4
6
8
0
Interpretacin
Negativo
Borderline
negativo
Positivo dbil
Positivo
Positivo fuerte
Sin cel,
contaminacin
Citotoxicidad dependiente de
C (CDC)
Agregado de Inmunoglobulina
Humana Mayor sensibilidad
Incrementa
probabilidad
de unin de C
Citotoxicidad dependiente de
C (CDC)
Limitaciones:
Determinamos presencia de anticuerpos citotxicos (fijadores
de complemento: IgM e IgG)
No permite distinguir entre la presencia de anticuerpos
relevantes en el trasplante (anti-HLA) y anticuerpos no
relevantes en el trasplante (por ejemplo, autoanticuerpos,
generalmente IgM).
Variante de la tcnica clsica:
Tratar los sueros con dithiotreitol (DTT) para eliminar la IgM.
Mediante este tratamiento slo detectaramos anticuerpos IgG
presentes en el suero.
Algunos anticuerpos de isotipo IgM pueden presentar especificidad antiHLA y se han asociado en casos aislados con rechazos hiperagudos y
con una menor supervivencia del injerto (Katznelson y cols., 2002; Smit
y cols., 1991; Taylor y cols., 1989; Chapman y cols., 1986).
Alo/Autoanticuerpos?
Aloanticuerpos: IgG
Autoanticuerpos: IgM
DTT: Rompe enlaces disulfuro que
unen al pentmero de IgM.
Suero + DTT
POSITIVO
NEGATIVO
IgG
IgM
Autoanticuerpos
Pac.con LES
Pac.tratados con antiarrtmicos candidatos a tx cardaco
Pac.tratados con medicacin antihipertensiva
PRA mayor 80% no especfico y reaccin fuerte
Crossmatch positivo entre hnos idnticos
Crossmatch positivo ,c/DTT negativo
Mayor reactividad al fro
Mayor reactividad a los LB
Citotoxicidad dependiente de
C (CDC)
Ventajas
No se necesita utilizar equipos de difcil
manejo y calibracin para la
interpretacin de los resultados.
En la prueba cruzada pre-trasplante es
la tcnica de referencia.
ELISA
Deteccin de anticuerpos presentes en un suero que
son capaces de reconocer antgenos purificados
adheridos a un soporte slido.
Revelado uso de un segundo anticuerpo marcado
con un enzima y adicin de un sustrato de la enzima
que origina una reaccin colorimtrica interpretada
por espectrofotometra.
ELISA
ELISA
Ventajas:
ELISA
Limitaciones de la tcnica
Slo podra utilizarse para el estudio de
anticuerpos anti-HLA presentes en el suero de
pacientes en lista de espera, pero no en la
prueba cruzada pretrasplante.
La fuente de la que se obtengan los antgenos
purificados es fundamental para la
interpretacinde resultados.
Algunas casas comerciales utilizan plaquetas
para obtener los antgenos por lo que estas
preparaciones a pesar de contener
tericamente slo molculas HLA suelen estar
contaminadas con antgenos plaquetarios que
pueden dar lugar a falsos positivos
Citometra de Flujo
Reaccin antgeno-anticuerpo sobre la superficie
celular visualizada mediante la utilizacin de un segundo
anticuerpo marcado con un fluorocromo y el uso de un
citmetro de flujo.
Tcnica de anlisis celular; medicin de caractersticas
de dispersin de luz y fluorescencia de las clulas.
Suspensin celular.
Las muestras son las mismas que para CDC, pero no es
necesario separar las poblaciones T y B, ya que el uso de
anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos
nos permite distinguirlas en el citmetro.
Las clulas deben tener tambin buena viabilidad
Es hasta cien veces ms sensibles que el mtodo de CDC
en la deteccin de anticuerpos en linfocitos y adems no
requiere fijacin del complemento (Stites y cols., 1997).
Citometra de Flujo
Antgeno
Superficie celular
Citometra de Flujo
Citmetro de Flujo:
Instrumento que
detecta cada clula
presente en una
corriente de lquido
iluminada por un
haz de lser
(Janeway y
cols.,2003).
Citometra de Flujo
Fundamento:
Estructura Bsica:
Sistema Fludrico
(inyeccin de la
muestra)
Sistema ptico
(Fuentes de luz)
Sistema Elctrico
(amplificadorconvertidor)
Citometra de Flujo
Parmetros celulares medidos:
El tamao celular relativo ( Forward Scatter o FSC)
La complejidad interna o granularidad relativa (Side
Scatter o SSC)
Intensidades relativas de emisin de fluorescencia
( FL1, FL2, FL3, FL4, etc.)
Complejida
d interna
Citometra de Flujo
Limitaciones de la tcnica
Se requiere de un aparataje sofisticado y
calibracin ptima del citmetro.
Determinamos es la presencia de anticuerpos
pero no permite distinguir entre la presencia de
anticuerpos relevantes y no relevantes en el
trasplante.
Para la determinacin del grado de PRA y de la
especificidad de los anticuerpos presentes en el
suero de los pacientes en lista de espera las
limitaciones son las mismas que en el caso de la
microlinfocitotoxocidad.
Citometra de Flujo
Ventajas
Mayor sensibilidad que CDC.
En determinados grupos de pacientes (aquellos en que
existe rechazo previo, los que presentan PRA elevado y
rin lmite) una prueba cruzada negativa con clulas T
utilizando la microlinfocitotoxicidad y positiva usando
citometra de flujo sera predictivo de una peor
supervivencia del injerto frente a un resultado de prueba
cruzada mediante citometra de flujo tambin negativo
(Martn y cols., 2003)
Permite diferenciar anticuerpos IgG de IgM
Luminex
Mtodo similar a la citometra
convencional, utiliza microesferas
recubiertas de molculas HLA en lugar
de clulas.
El uso de la citometra de flujo permite
el escrutinio de anticuerpos sricos
frente a antgenos HLA con una
sensibilidad mayor que el mtodo
convencional de microlinfocitotoxicidad
dependiente de complemento.
PMT
Photo Multiplier Tube/Rep
Reporter Laser
Classification Laser
Avalanche Photo
Diodes/CL
Luminex
Limitaciones de la tcnica
No puede ser utilizado en la prueba cruzada pretrasplante.
Se requiere de un aparataje sofisticado y calibracin
ptima del citmetro.
La fuente de la que se obtengan los antgenos purificados
es fundamental para la interpretacin de resultados.
Elevados costes.
Ventajas
Permite determinar de manera rpida la PRA y
especificidad de los sueros de pacientes incluidos en lista
de espera.
Tericamente se detectan slo anticuerpos frente a
molculas HLA.
La sensibilidad de la tcnica es comparable a la de la
citometra convencional.
SIGNIFICACIN CLNICA
TEORA HUMORAL.
Nuevas Hiptesis
Si la Teora Humoral es aceptada, pacientes que presentan anticuerpos
pueden ser tratados con inmunosupresin hasta que los anticuerpos
desaparezca, para demostrara hasta donde el rechazo crnico puede ser
bloqueado.
En pacientes que no presentan anticuerpos, la inmunosupresin puede ser
reducida hasta que aparezcan los anticuerpos.
Conclusiones
Avances en materia de deteccin de
anticuerpos Anti-HLA.
Anticuerpos Anti-HLA son predictores de
Rechazo Crnico y aparecen antes de
que este se produzca.
Principalmente Anticuerpos Anti-HLA II
estn involucrados en Falla del Injerto.
Nuevas lneas de investigacin para
tratamiento de desensibilizacin y
evitar progresin a Fallo de Injerto.
MUCHAS GRACIAS!