PRODUCCIN

MICROBIANA DE
ENZIMAS
Bioqumica General

Semestre 2017-1

Produccin microbiana de enzimas

Los microorganismos han

aumentado su importancia
como productores de enzimas
industriales.
Amilasa y endoglucanasas de
cereales por las de Bacillus y
Aspergillus, en cerveza,
panificacin y destilera.
Proteasa vegetales y animales
por las de Aspergillus para
suavizacin de carne y
cerveza.
Renina por renina
microbiana de Mucor para
fabricacin de quesos.

Ventajas
Diversidad
Incremento de la produccin mediante
manipulacin gentica.
Tiempos cortos de generacin.
Costo
Mayor control de las condiciones mayor
rendimiento.

Clasificacin por su localizacin in vivo

Extracelulares:
Son sintetizadas dentro de la
clula y secretadas al espacio
extracelular.

Intracelulares:
Son sintetizadas y utilizadas
dentro de la clula.

Biosntesis de la enzima

Regulacin de la expresin gentica

Proceso mediante el cual la expresin de los

genes se activa (se prende) o se inactiva (se
apaga) bajo diferentes condiciones.

Por qu las clulas regulan la

expresin de sus genes?
Una clula slo expresa los genes que
requiere en un ambiente particular de tal
manera que no haya desperdicio de energa.

Apaga genes cuyos productos podran

interferir con el proceso que se est llevando
a cabo.

Regulan genes como parte del proceso de

desarrollo.

PRODUCCIN
DE LA ENZIMA

 Fermentacin
Seleccin de la cepa

Cultivo puro
Crecimiento rpido y vigoroso
Que produzca lo que queramos
No subproductos txicos
Produccin en tiempos cortos
Genticamente estable
Conservacin por perodos largos

Seleccin de las condiciones de proceso

Extraccin
Purificacin

Estructura de las protenas

Figure 6-1

Extraccin

Ruptura
celular

Mecnica

Molienda con vidrio

Homogenizador
Sonicador
Prensa Francesa

No mecnica

Fsicos

Qumicos

Enzimticos

Choque osmtico

Detergentes

Enzimas lticas

Desecacin

Solventes

Congeladodescongelado

Hidrxido-hipoclorito

Riesgos de dao para la enzima durante la ruptura celular

Heat

All mechanical methods require a large input of energy, generating heat.

Cooling is essential for most enzymes. The presence of substrates,
substrate analogues or polyols may also help stabilize the enzyme.

Shear

Shear forces are needed to disrupt cells and may damage enzymes,
particularly in the presence of heavy metal ions and/or an air interface.

Proteases

Disruption of cells will inevitably release degradative enzymes which may

cause serious loss of enzyme activity. Such action may be minimized by
increased speed of processing with as much cooling as possible. This
may be improved by the presence of an excess of alternative substrates
(e.g. inexpensive protein) or inhibitors in the extraction medium.

pH

Buffered solutions may be necessary. The presence of substrates, substrate

analogues or polyols may also help stabilize the enzyme.

Chemical

Some enzymes may suffer conformational changes in the presence of

detergent and/or solvents. Polyphenolics derived from plants are potent
inhibitors of enzymes. This problem may be overcome by the use of
adsorbents, such as polyvinylpyrrolidone, and by the use of ascorbic
acid to reduce polyphenol oxidase action.

Oxidation

Reducing agents (e.g. ascorbic acid, mercaptoethanol and dithiothreitol) may

be necessary.

Foaming

The gas-liquid phase interfaces present in foams may disrupt enzyme

conformation.

Heavy-metal
toxicity

Heavy metal ions (e.g. iron, copper and nickel) may be introduced by
leaching from the homogenisation apparatus. Enzymes may be
protected from irreversible inactivation by the use of chelating reagents,
such as EDTA.

Purificacin

Procesos de Fraccionamiento
Para concentrar una protena en particular
a partir de una mezcla compleja
No hay receta universal: ensayo y error
En cada paso, la protena total se divide
en una serie de fracciones; en cada una
se busca la protena de inters mediante
ensayo especfico
Fraccionamiento exitoso: una fraccin con
alta actividad especfica en donde se haya
aumentado la pureza de la muestra

Precipitacin de las protenas

La solubilidad depende de:
Interacciones polares
Interacciones hidrofbicas entre las protenas
Fuerzas de repulsin electroestticas
Zonas cargadas positivas

Zonas cargadas negativas

Zonas hidrofbicas (no

polares)

Precipitacin:
Salting-out
Punto isoelctrico
Solventes
Coagulacin y
floculacin

Precipitacin con Sal

Es una de las metodologas ms utilizadas. Las
sales que ms se utilizan son el sulfato de
amonio y el sulfato de sodio.

Las Curvas de solubilidad

presentan dos zonas:
Zona solubilizacin o
salting-in
Zona de precipitacin
o salting-out
Todos estos procesos se realizan a temperaturas inferiores a 5C

Precipitacin Isoelctrica

Las protenas con carga se repelen. Si se trabaja

cerca del pI de las protenas stas presentan una
carga mnima y no hay repulsin y tienden a una
atraccin mnima.

Fraccionamiento con Solventes Orgnicos

Diferente solubilidad de las protenas en solucin acuosa
a solventes orgnicos: etanol, acetona, butanol
Solvente: disminuye constante dielctrica del medio
aumenta atraccin entre molculas cargadas y
disminuye su interaccin con el agua
Solubilidad de la protena disminuye: grupos
hidrofbicos son protegidos por solvente y grupos
inicos son dominantes
Puede haber denaturalizacin y se pierde actividad

Precipitacin por Polmero no inico

Los polmeros reducen la cantidad efectiva de
agua disponible para la solvatacin de las
protenas.
Por ejemplo: polietiln glicol

Cromatografa
La cromatografa es un conjunto de
tcnicas basadas en el principio de
retencin selectiva cuyo objetivo es
separar los distintos componentes
de una mezcla y en algunos casos
identificar estos si es que no se
conoce su composicin.

Las tcnicas cromatogrficas son

muy variadas, pero en todas ellas
hay una fase mvil que consiste en
un fluido (gas o lquido) que arrastra
a la muestra a travs de una fase
estacionaria que se trata de un
slido o un lquido fijado en un
slido.

Cromatografa de
intercambio inico

Cromatografa de
filtracin en gel

Cromatografa de afinidad

Cromatografa
de afinidad

Electroforesis

Electroforesis
desnaturalizante
SDS-PAGE
Ctodo

Pozos
para
muestras
Amortiguador

Gel
apilador
Gel
separador
nodo

Amortiguador

Composicin de preparaciones
enzimticas
Constituent
Enzyme-active protein

Enzyme preparation (% w/w)

Liquid
Powder
0.5-5.0

1-8

2-5

1-5

90

16-18

2-5

Color

0.05-1.0

Not added

Preservatives

0.2-1.0

Not added

Flavor mask

0.05-0.2

0.1-0.3

90

3-5

Inactive protein
Standardizing diluent
Electrolytes

Water