MTODOS DE

DETECCIN

 LOCALIZACIN

COMPLEJO Ag-Ac TISULAR EXIGE UNIN DE

ANTICUERPOS A MARCADORES QUE PERMITAN SU DETECCIN

FLUORESCENTES: INMUNOFLUORESCENCIA

PERMITE VISUALIZACIN DIRECTA DE FLUOROCROMO EN MICROSCOPIO

DE FLUORESCENCIA

ENZIMTICOS: INMUNOHISTOQUMICA

REQUIERE REVELADO
MICROSCOPIO PTICO

UTILIZA CROMGENOS O METALES PESADOS

DE

ENZIMA

ANTES

DE

VISUALIZACIN

COONS et als. (1941): UTILIZAN ANTICUERPO MARCADO CON

ISOCIANATO DE FLUORESCENA
(INMUNOFLUORESCENCIA)

MARCANDO

BACTERIAS

MARCADOR REEMPLAZADO POR ISOTIOCIANATO DE FLUORESCEAN

(FITC)

MS ESTABLE Y DE FCIL CONJUGACIN

 NAKANE

y PIERCE (1966); AVRAMEAS y URIEL (1966):

MARCACIN ANTICUERPOS CON PEROXIDASA DE RBANO
PICANTE (HRP, BASE DE LA INMUNOHISTOQUMICA)

NAKANE (1968): MARCACIN MLTIPLE MEDIANTE ANTICUERPOS

OBTENIDOS EN LA MISMA ESPECIE ANIMAL

TAYLOR

y BURNS (1979): DEMUESTRAN APLICABILIDAD EN

TEJIDOS FIJADOS EN FORMALDEHDO E INCLUDOS EN
PARAFINA.

MARCACIN INMUNOGLOBULINAS EN CLULAS PLASMTICAS

 MTODOS DE CONJUGACIN

MTODO CONJUGADO DIRECTO

MTODO CONJUGADO INDIRECTO

MTODO DE PUENTE
MTODO DE COMPLEJO PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA (PAP)
MTODO DE FOSFATASA ALCALINA ANTI FOSFATASA ALCALINA (APAAP)
MTODO DEL COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA (ABC)
MTODO DE BIOTINA-ESTREPTAVIDINA MARCADA (LSAB)

 MTODOS DE POLMEROS

MTODO EPOS
MTODO ENVISION
MTODO POWERVISION

MTODO DE AMPLIFICACIN

AMPLIFICACIN POR TIRAMIDA

MTODO RCA

MTODOS DE CONJUGACIN

MTODO CONJUGADO DIRECTO

MARCADOR EST UNIDO AL ANTICUERPO PRIMARIO

INCONVENIENTES:

NECESIDAD DE CONJUGACIN DE ENZIMA A CADA ANTICUERPO

PRIMARIO

COMPLEJO
COSTOSO

USO DE ANTICUERPO PRIMARIO A ALTA CONCENTRACIN

SEAL DBIL

MTODO CONJUGADO INDIRECTO

MARCADOR EST UNIDO A UN ANTICUERPO SECUNDARIO

VENTAJAS:

SIMPLIFICA LA CONJUGACIN (CONJUGA SLO ANTICUERPO SECUNDARIO)

ECONOMA: ABARATA COSTOS, ADEMS DE PERMITIR QUE ANTICUERPO PRIMARIO SE

UTILICE MS DILUIDO

VERSATILIDAD: ANTICUERPO CONJUGADO PUEDE EMPLEARSE DETECTANDO MLTIPLES

ANTICUERPOS PRIMARIOS (SIEMPRE QUE SEAN OBTENIDOS DE UNA MISMA ESPECIE
ANIMAL)

GRACIAS

A ELLO LA INMUNOHISTOQUIMICA SE ENFOCA EN AUMENTAR LA

SENSIBILIDAD DE LA TCNICA

LIMITACIONES:

PEQUEAS CANTIDADES DE ANTGENO PUEDEN NO SER DETECTABLES ESPECIALMENTE

TRAS FIJACIN PROLONGADA

MTODO DE PUENTE
MASON ET AL (1969)

 USO DE ANTICUERPO SECUNDARIO ANTI-ESPECIE

ANTICUERPO PUENTE ENTRE

ANTICUERPO PRIMARIO Y ANTICUERPO ANTI-PEROXIDASA

OBTENIDOS EN LA MISMA ESPECIE ANIMAL

ANTICUERPO PUENTE RECONOZCA Fc DE AMBOS

VENTAJAS:

ELIMINACIN CONJUGACIN DE Ac CON ENZIMA

ACOPLAMIENTO POR UNIN INMUNOLGICA

AUMENTA SENSIBILIDAD

MTODO DE COMPLEJO
PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA (PAP)
STERNBERGER ET AL (1970)

 3 ETAPAS SIMILARES A MTODO DE PUENTE

UTILIZADO INICIALMENTE PARA DETECCIN DE Treponema pallidum

RECONOCE AL ANTGENO

Ac PRIMARIO O ESPECFICO
Ac SECUNDARIO, DE UNIN O PUENTE

CONTRA LA ESPECIE EN QUE SE OBTUVO EL Ac PRIMARIO

COMPLEJO PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA

3 MOLCULAS DE PEROXIDASA (Mm= 40kDa)

2 MOLCULAS DE ANTICUERPO ANTIPEROXIDASA (Obtenido en la
misma especie que Ac Primario para permitir formacin de puente).
(Mm COMPLEJO= 400-430 kDa)

 SE IMPUSO EN RUTINA DE INMUNOHISTOQUMICA POR SU SENSIBILIDAD 100-1000

VECES MAYOR QUE MTODOS DE CONJUGACIN

ALTA ESPECIFICIDAD, Y ADEMS ALTA ESTABILIDAD OTORGADA POR COMPLEJO PAP

AUMENTO DE SENSIBILIDAD PERMITI UTILIZAR TCNICA EN CORTES DE TEJIDOS FIJADOS EN

FORMALINA E INCLUIDOS EN PARAFINA (HASTA ENTONCES SLO SE USABAN CORTES EN
CONGELACIN)

GENER UNA REVOLUCIN EN EL USO DE LA METODOLOGA

PERMITI APLICARLA AL DIAGNSTICO DE PATOLOGAS

REVELADO PEROXIDASA: TETRACLORHIDRATO DE 3,3-DIAMINOBENCIDINA (DAB)

ENZIMA ACTA SOBRE SUSTRATO PERXIDO DE HIDRGENO (H 2O2)
PRODUCIENDO H2O + O-, QUE OXIDA AL CROMGENO DAB

DAB

OXIDADO FORMA PRECIPITADO MARRN INSOLUBLE EN ALCOHOL, LO QUE

PERMITE DESHIDRATACIN DE PREPARACIONES Y MONTAJE EN MEDIO
PERMANENTE HIDRFOBO.

PRECIPITADO DAB OXIDADO PUEDE INTENSIFICARSE MEDIANTE OSMIO, PLATA, NQUEL

O COBALTO

NO RECOMENDABLE DADO QUE AUMENTA FONDO INESPECFICO

OTROS CROMGENOS UTILIZABLES CON PEROXIDASA

4 CLORO-1-NAFTOL: PRECIPITADO AZUL-VIOLETA

ALFA-NAFTOL PIRONINA: PRECIPITADO PRPURA

3-AMINO-9-ETILCARBAZOL (AEC): PRECIPITADO ROJO

REACTIVO DE HANKER-YATES (p-FENILENDIAMINO DIHIDROCLORURO/PIROCATECOL): PRECIPITADO
AZUL PRPURA INSOLUBLE EN ALCOHOL

FORMAN PRECIPITADOS SOLUBLES EN ALCOHOL (EXCEPTO REACTIVO DE HANKERYATES)

PREPARACIONES DEBEN MONTARSE EN MEDIO HIDRFILO
DEBIDO A ESTO SE UTILIZA DE RUTINA DAB, MIENTRAS LOS CROMGENOS
ALTERNATIVOS SE EMPLEAN CUANDO SE REQUIERE DOBLE TINCIN

 DAB: PRESUNTAMENTE CARCINOGNICA AUNQUE DE BAJO RIESGO

CONDICIONES DE TRABAJO SEGURAS DADAS LAS NFIMAS CANTIDADES UTILIZADAS Y EL

USO DE SOLUCIONES YA PREPARADAS QUE DISMINUYEN POSIBLE INHALACIN AL MANEJAR

DAB EN POLVO Y PESARLO

HISTOGREEN: SUSTITUTO DE DAB, NO TXICO, PRODUCE PRECIPITADO VERDE

MENOS ESTABLE EN ALCOHOL Y AGUA

TENDENCIA A SOBRETINCIN RPIDA

BENCIDINA SERA SUSTANCIA TXINA MS QUE DAB

SON SUSTANCIAS DIFERENTES

VENTAJAS

TAMAO PEQUEO, PERMITE UNIN DE ANTICUERPOS

OBTENCIN FCIL EN FORMA PURIFICADA
ENZIMA ESTABLE
AMPLIO RANGO DE CROMGENOS UTILIZABLES

 INCONVENIENTES

POSIBLE EXISTENCIA DE PEROXIDASA ENDGENA EN TEJIDOS

ABUNDA EN SISTEMA HEMATOPOYTICO (NEUTRFILOS, EOSINFILOS, CLULAS MIELOIDES, MONOCITOS), HEPATOCITOS, RIN

HEMOPROTENAS COMO HEMOGLOBINA O MIOGLOBINA Y CITOCROMOS DE GRANULOCITOS Y MONOCITOS TAMBIN REPRESENTAN

PROBLEMA TCNICO

DETECCIN PEROXIDASA ENDGENA MEDIANTE CONTROLES NEGATIVOS DE INCUBACIN TISULAR CON SUSTRATO Y
CROMGENO DAB

FCIL ELIMINACIN DE PEROXIDASA ENDGENA:

ANTES DE REVELADO MEDIANTE SOLUCIN DE PERXIDO DE HIDRGENO 0,5% EN METANOL

USO DE HIDRATO DE CICLOPROPANONA, QUE PRESERVA ADECUADAMENTE ANTIGENICIDAD

USO DE PERXIDO DE HIDRGENO 3% EN AGUA DESIONIZADA (0,03% EN CITOLOGAS PARA EVITAR ALTERAR MORFOLOGA
CELULAR)

INCUBACIN SE REALIZA DESPUS DE ANTICUERPO PRIMARIO, A FIN DE EVITAR DAO DEL PERXIDO DE HIDRGENO SOBRE
EPITOPOS

ADICIN AZIDA SDICA 0,1% A PERXIDO DE HIDRGENO 0,3%

ELIMINACIN ACTIVIDAD PEROXIDASA ENDGENA MEDIANTE MICROONDAS

SUSTITUIR PEROXIDASA POR FOSFATASA ALCALINA O GLUCOSA OXIDASA (NO PRESENTE EN TEJIDOS HUMANOS)

MTODO DE FOSFATASA ALCALINAANTIFOSFATASA ALCALINA(APAAP)

CORDELL ET AL (1984)

 SIMILAR A MTODO PUENTE

SUSTITUYE PEROXIDASA POR FOSFATASA ALCALINA (ENGVALL &

PERLMAN, 1971)
EVITA PROBLEMAS INHERENTES A PEROXIDASA ENDGENA
COMPLEJO MUY ESTABLE Mm 560 kDa

FOSFATASA ALCALINA INTESTINAL (Mm 80kDa) ACTIVADA POR

Mg++, Mn++ o Ca++, HIDROLIZA STERES NAFTOL FOSFATO

(SUSTRATO)

ORIGINA FOSFATOS Y COMPUESTOS FENLICOS

LOS FENOLES REACCIONAN CON SALES DE DIAZONIO INCOLORAS
(CROMGENO), FORMANDO COLORANTES AZO

 CROMGENOS UTILIZADOS

FAST RED TR, PRODUCE PRECIPITADO ROJO SOLUBLE EN ALCOHOL

NEW FUCHSIN, PRECIPITADO ROJO MUY INTENSO, INSOLUBLE EN ALCOHOL

FAST BLUE BB, PRODUCE PRECIPITADO AZUL SOLUBLE EN ALCOHOL

NITRO BLUE TETRAZOLIUM/5-BROMO-4-CHLORO-3-INDOLYL PHOSPHATE
PRODUCE PRECIPITADO AZUL MUY INTENSO POCO SOLUBLE EN ALCOHOL

(NBT/BCIP),

PRECIPITADOS SOLUBLES EN ALCOHOL EXIGEN MONTAJE EN MEDIO HIDRFILO

AUNQUE PUEDEN SECARSE PARA LUEGO MONTARSE EN MEDIO HIDRFOBO

EVITAR

CONTRATINCIN CON HEMATOXILINA

USANDO HEMATOXILINA DE MAYER

ALCOHLICA

DE

HARRIS,

NBT/BCIP PERMITE DESHIDRATACIN EN ALCOHOL SIEMPRE QUE SEA RPIDA

CROMGENOS AZULES DEBEN SER CONTRASTADOS CON ROJO NUCLEAR

NO SE DEBE EMPLEAR TAMPN FOSFATO PARA NO AFECTAR LA

ACTIVIDAD FOSFATASA ALCALINA

ACTIVIDAD FOSFATASA ALCALINA ENDGENA SE LOCALIZA EN PLACENTA,

INTESTINO, CLULAS SANGUNEAS, CLULAS RETICULARES, ENDOTELIO,
MDULA SEA, OSTEOBLASTOS, RIN E HGADO.

NO SUELE REPRESENTAR PROBLEMA EN MUESTRAS INCLUIDAS EN PARAFINA DADO

QUE SE INHIBE MEDIANTE CALOR

SIN EMBARGO, GENERA INCONVENIENTES EN CORTES EN CONGELACIN

LEVAMISOL INHIBE FOSFATASA ALCALINA EXCEPTO LA PLACENTARIA E INTESTINAL

INHIBICIN MEDIANTE
CROMGENO

LEVAMISOL

(1-5mM)

APLICADO

EN

INHBIR MEDIANTE HCl 0,03 N o CIDO ACTICO GLACIAL 20%

ALTERNATIVAMENTE PUEDE SUSTITUIRSE POR GLUCOSA OXIDASA

CONJUNTO

CON

 PEROXIDASA Y FOSFATASA ALCALINA USADAS EN CONJNTO

PERMITIRAN REALIZAR DOBLES TINCIONES

OTRAS ENZIMAS UTILIZADAS, AUNQUE MENOS FRECUENTEMENTE (SE

USAN MS BIEN EN DOBLES O TRIPLES TINCIONES):

GLUCOSA OXIDASA: REVELA MEDIANTE NBT (NITROBLUE

TETRAZOLIUM) DANDO PRECIPITADO DE COLOR AZUL MARINO

INSOLUBLE EN ALCOHOL

NO EXISTE EN TEJIDOS HUMANOS

-D-GALACTOSIDASA, PRECIPITADO AZUL TURQUESA INSOLUBLE EN

ALCOHOL

ACTIVIDAD ENDGENA EN MAMFEROS NO ES OBSTCULO DADO QUE

REACCIONA A DIFERENTE pH

MTODO DEL COMPLEJO AVIDINA

BIOTINA (ABC)
HSU ET AL (1981)

 BASADO EN ALTA AFINIDAD ENTRE AVIDINA Y BIOTINA

BIOTINA (VITAMINAS B7 Y B8 O TAMBIN LLAMADA VITAMINA H, HIDROSOLUBLE, 244 kDa): SE

PUEDE UNIR A AVIDINA (PRESENTE EN CLARA DE HUEVO)

PRESENTE EN CLULAS RICAS EN MITOCONDRIAS

HEPATOCITOS, TBULOS CONTORNEADOS RENALES, CONDUCTOS ESTRIADOS DE GLNDULAS SALIVALES,
ONCOCITOS, CLULAS DE SERTOLI, CLULAS PARIETALES GSTRICAS, PLEXOS COROIDEOS, VAINAS DE
MIELINA Y MASTOCITOS

AVIDINA: GLICOPROTENA BSICA, 67 kDa, PRESENTE EN CLARA DE HUEVO

4 SUBUNIDADES DE 128 aa, c/u PRESENTA PUNTOS HIDROFBICOS DE UNIN A BIOTINA

UNIN AVIDINA-BIOTINA MEDIANTE ENLACES NO COVALENTES

UNA DE LAS UNIONES QUMICAS MS FUERTES CONOCIDAS (Kd=10 -15M)

Kd DE UNIN ANTGENO-ANTICUERPO ENTRE 10 -9 Y 10-12 M,

CONJUGACIN DE BIOTINA CON DIFERENTES MOLCULAS

ANTICUERPOS (HASTA 150 MOLCULAS DE BIOTINA POR 1 DE ANTICUERPO)

ENZIMAS (PEROXIDASA, FOSFATASA ALCALINA)
FLUOROCROMOS (FLUORESCENA, RODAMINA)

3 ETAPAS

COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA-ENZIMA

Ac PRIMARIO
Ac SECUNDARIO (ANTI ESPECIE)
BIOTINILADO)

 AUMENTA

SENSIBILIDAD DE LA TCNICA

MAYOR NMERO DE MOLCULAS DE ENZIMA INTRODUCIDAS POR CADA

MOLCULA DE ANTICUERPO

KITS COMERCIALES TIENEN YA ESTABLECIDAS Y CALCULADAS LAS

PROPORCIONES DE AMBOS COMPONENTES PARA CONSEGUIR ESTE
PROPSITO

COMPLEJO

AVIDINA-BIOTINA-ENZIMA DEBE PREPARARSE 30

MINUTOS ANTES DE UTILIZARLO

AVIDINA NO DEBE SATURARSE DE BIOTINA-ENZIMA PUES UNO

DE SUS 4 PUNTOS DE UNIN DEBE QUEDAR LIBRE PARA

PODER ANCLARSE A BIOTINA DE LA SEGUNDA CAPA

 SUSTITUCIN AVIDINA POR ESTREPTOAVIDINA (MTODO SABC)

NO TIENE COMPONENTE CARBOHIDRATO (EVITA UNIN INESPECFICA A

LECTINAS POR PARTE DE AVIDINA)

PUNTO ISOELCTRICO ES MS ALTO (EVITA UNIN ELECTROSTTICA PROPIA

DE AVIDINA, CUYO P.I. ES 10 POR LO QUE SE UNE A ESTRUCTURAS CARGADAS
NEGATIVAMENTE (NCLEOS)

STREPTAVIDINA: PROTENA TETRAMRICA ANLOGA A AVIDINA

SE EXTRAE DE Streptomyces avidinii PRESENTA Mm 60 kDa

MTODO DE LA BIOTINAESTREPTAVIDINA MARCADA (LSAB)

STERNBERGER ET AL (1970)

SIMILAR A MTODO ABC

ENZIMA UNIDA A ESTREPTAVIDINA

ESTABILIDAD COMPLEJO
ESTREPTAVIDINA-PEROXIDASA ES
MAYOR

EL COMPLEJO ESTREPTAVIDINAPEROXIDASA PUEDE SER DILUIDO Y

ALMACENADO DURANTE LARGO
TIEMPO

MAYOR SENSIBILIDAD DE LA TCNICA

 BIOTINA (VITAMINAS B7 Y B8): SE PUEDE UNIR A AVIDINA (PRESENTE

EN CLARA DE HUEVO)

PRESENTE EN CLULAS RICAS EN MITOCONDRIAS

HEPATOCITOS, TBULOS CONTORNEADOS RENALES, CONDUCTOS ESTRIADOS DE
GLNDULAS SALIVALES, ONCOCITOS, CLULAS DE SERTOLI, CLULAS PARIETALES
GSTRICAS, PLEXOS COROIDEOS, VAINAS DE MIELINA Y MASTOCITOS

BIOTINA ENDGENA IMPLICA PROBLEMA SERIO ESPECIALMENTE EN

CORTES EN CONGELACIN

FIJACIN EN FORMALINA E HISTOPROCESAMIENTO CON INCLUSIN FINAL EN

PARAFINA ENMASCARAN ACTIVIDAD BIOTINA

RECUPERACIN ANTIGNICA PUEDE DESENMASCARARLA

BLOQUEO EN DOS ETAPAS

INCUBACIN CON AVIDINA (1mg/mL, 20 MINUTOS) PARA BLOQUEAR BIOTINA

ENDGENA

SEGUNDA FASE DE INCUBACIN CON BIOTINA (0,1 mg/mL, 20 MINUTOS) PARA

BLOQUEAR AVIDINA AADIDA

MTODO DE POLMEROS
BISGAARD ET AL, 1993

 INTENTO POR RESOLVER PROBLEMAS ASOCIADOS A BIOTINA

ENDGENA

UTILIZA POLMEROS A LOS QUE SE UNEN ANTICUERPOS Y ENZIMAS

EVITA EMPLEO DE BIOTINA
MANTIENE O AUMENTA SENSIBILIDAD DE LA TCNICA

MTODO EPOS (ENHANCED POLYMER

ONE STEP STAINING)
PLUZEK(1993)

 UNA SOLA ETAPA

UTILIZACIN

DE 1 POLMERO HIDROSOLUBLE DE DEXTRANO

CONJUGADO COVALENTEMENTE CON Ac PRIMARIO (10 MOLCULAS) Y
ENZIMA (70 MOLCULAS)

TCNICA DIRECTA Y RPIDA

TIEMPO DE INMUNOTINCIN: 10 MINUTOS

FACTIBILIDAD DE APLICACIN EN BIOPSIA INTRAOPERATORIA

LIMITANTES:

SLO PUEDE EMPLEARSE ANTICUERPO S PRIMARIOS

CONJUGADOS CON EL POLMERO POR EL PROVEEDOR

POCA VERSATILIDAD

MTODO Envision
SABATINI ET AL. 1998

PROBLEMA REPRESENTADO POR CONJUGACIN DE Ac PRIMARIOS RESUELTO MEDIANTE ESTE MTODO

AUNQUE SIMILAR A EPOS, CONSTA DE 2 ETAPAS

UNIN DEL Ac PRIMARIO AL ANTGENO CITO-HISTOLGICO

COMPLEJO DE POLMEROS DE DEXTRANO CONJUGADO CON Ac SECUNDARIOS ANTIESPECIE (ANTI-RATN O ANTI-CONEJO;
20 MOLCULAS) + PEROXIDASA O FOSFATASA ALCALINA(100 MOLCULAS)

MAYOR SENSIBILIDAD

TIEMPO DE INMUNOTINCIN APROXIMADO: 15 MINUTOS

APLICABLE A BIOPSIA INTRAOPERATORIA

PUEDE REALIZARSE TAMBIN EN 45 MINUTOS EN CORTES EN PARAFINA UTILIZANDO RADIACIN

INTERMITENTE CON MICROONDAS

SENSIBILIDAD RESPECTO A SISTEMAS ABC/LSAB DISCUTIBLE

ALGUNOS SEALAN QUE ES SUPERIOR

OTROS AUTORES INDICAN QUE SON SIMILARES

EVITA MARCAJE DE BIOTINA ENDGENA Y FONDO INESPECFICO

OTRO GRUPO DE INVESTIGADORES SEALA QUE ES INFERIOR

SENSIBILIDAD EN ORDEN DECRECIENTE: LSAB>EnVision>ABC

MTODO Powervision

 OBSTCULO ESPACIAL

DEXTRANO POSEE ALTA MASA MOLECULAR

DISPOSICIN TRIDIMENSIONAL COMPLEJA

COMPROMISO ACCESO POLMERO A ANTGENOS PRXIMOS

SEGUNDA GENERACIN DE POLMEROS
UTILIZAN PEQUEAS MOLCULAS CAPACES DE POLIMERIZAR CON ANTICUERPO SECUNDARIO Y
MOLCULAS DE ENZIMA LINEALES Y COMPACTAS

UNIN DE MLTIPLES CONJUGADOS A ANTGENOS PRXIMOS, AUMENTA EFICIENCIA Y

SENSIBILIDAD

MTODO DE AMPLIFICACIN

 MOLCULA DE TIRAMIDA BIOTINADA

SE

EMPLEA EN UNA
INMUNOHISTOQUMICA.

RECIENTE

TCNICA

DE

AMPLIFICACIN

DE

SEAL

SISTEMAS DE DETECCIN BASADOS EN TIRAMIDA: STA SE UNE A PEROXIDASA

MOLCULAS

DE BIOTINA ACTAN COMO PUNTOS DE UNIN A COMPLEJOS MARCADOS

DE ESTREPTAVIDINA-BIOTINA.

AUMENTO

DE SENSIBILIDAD CON ALGUNOS ANTICUERPOS PRIMARIOS ENTRE 500 A

1000 VECES MAYOR QUE CON SISTEMAS CONVENCIONALES DE DETECCIN.

SIN

EMBARGO, NO TODOS LOS ANTICUERPOS MUESTRAN EL MISMO BENEFICIO O

AMPLIFICACIN.

APLICACIONES: INMUNOHISTOQUMICA, HIBRIDACIN IN SITU.

MTODO DE AMPLIFICACIN POR TIRAMIDA (TSA

TIRAMIDE SIGNAL AMPLIFICATION; CSA
CATALYZED SIGNAL AMPLIFICATION; CARD
CATALYZED REPORTER DEPOSITION)
BOBROW 1989; ADM 1992

TIRAMIDA BIOTINILADA

 DEPSITO DE TIRAMIDA MARCADA CATALIZADO POR

PEROXIDASA

TIRAMIDA: COMPUESTO FENLICO QUE TRAS PEROXIDACIN

ORIGINA PRODUCTO OXIDADO ALTAMENTE INESTABLE Y
REACTIVO

RADICAL LIBRE UNIDO RPIDA Y COVALENTEMENTE A PROTENAS

PRXIMAS

AMINOCIDOS AROMTICOS RICOS EN ELECTRONES COMO TIROSINA,

TRIPTOFANO, HISTIDINA Y FENILALANINA)

 UNIN TIRAMIDA-PROTENAS INESPECFICA

SIEMPRE CON PROTENAS CELULARES PRXIMAS A

PEROXIDASA EN SITIO DE UNIN ANTGENO-ANTICUERPO

PROXIMIDAD DE UNIN POR CORTA VIDA MEDIA DE TIRAMIDA

OXIDADA, EVITA DISPERSIN DE SEAL

 MARCAJE DE TIRAMIDA CON BIOTINA (SISTEMA CSA)

REACCIN IHQ CLSICA TIPO ABC O SABC + INCUBACIN CON TIRAMIDA BIOTINILADA
PEROXIDASA OXIDA A TIRAMIDA BIOTINILADA INDUCIENDO DEPSITO
AMPLIFICACIN NMERO DE MOLCULAS DE BIOTINA
DETECCIN POSTERIOR DE BIOTINA (STREPTAVIDINA-PEROXIDASA, DAB)
APLICACIN REPETITIVA EN DISTINTOS CICLOS, INCREMENTNDOSE LA SEAL, AUNQUE

NO PASA DE 2 O 3 CICLOS DADO EL INCREMENTO DEL FONDO INESPECFICO PRODUCIDO

AL AUMENTAR SU NMERO, ESPECIALMENTE EN TEJIDOS RICOS EN BIOTINA

TIRAMIDA FLUORESCEINADA (SISTEMA

CSA II)

EVITA PROBLEMAS ASOCIADOS A BIOTINA

ENDGENA

UTILIA UN ANTICUERPO CONTRA ESPECIE EN

QUE SE OBTUVO AC PRIMARIO MARCADO CON
PEROXIDASA

PEROXIDASA OXIDAR TIRAMIDA

CONVERTIDA EN SEAL CROMOGNICA

MEDIANTE AC ANTI-FLUORESCENA MARCADO
CON PEROXIDASA YREVELADO CON
DIAMINOBENCIDINA

FLUORESCENA DETECTABLE DIRECTAMENTE

MEDIANTE MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

 AMPLIFICACIN AUMENTA SENSIBILIDAD 100 VECES,

PERMITIENDO DETECTAR ANTGENOS POCO ABUNDANTES EN

CORTES DE PARAFINA (ANTES SE REQUERA HACER SLO
CORTES POR CONGELACIN)
AMPLIFICACIN CON TIRAMIDA SE RESERVA NICAMENTE
PARA ANTGENOS MUY DIFCILES DE DETECTAR
REQUIERE PASOS ADICIONALES EN LA TCNICA Y AUMENTA
EL FONDO INESPECFICO POST APLICACIN

MTODO DE AMPLIFICACIN
ROLLING CIRCLE
AMPLIFICATION (RCA)
GUSEV 2001

 SISTEMA DE AMPLIFICACIN ISOTRMICA DE

OLIGONUCLETIDOS
INICIALMENTE USADO EN DETECCIN DE CIDOS NUCLEICOS
(AMPLIFICACIN 109)
ADAPTADA A INMUNOHISTOQUMICA

ANTICUERPO SECUNDARIO LIGADO A OLIGONUCLETIDO CORTO

UNA VEZ UNIDO A TEJIDO SE AADE SONDA CIRCULAR COMPLEMENTARIA DEL

OLIGONUCLETIDO

YA HIBRIDADOS EL OLIGONUCLETIDO ACTUAR COMO PRIMER Y LA SONDA

CIRCULAR COMO TEMPLATE (MOLDE)

MEDIANTE DNApol EL CIRCULO RUEDA Y SE EXTIENDE LINEALMENTE EL ADN,

POSTERIORMENTE HIBRIDADO MEDIANTE OLIGONUCLETIDOS COMPLEMENTARIOS
MARCADOS (P.E. BIOTINA)

POSTERIORMENTE SE REALIZA REVELADO

SENSIBILIDAD 75 VECES MAYOR EN INMUNOENSAYOS

NO MASIFICADO DEBIDO A COMPLEJIDAD TCNICA

CROMGENOS

(DEL GRIEGO KHRMA, COLORYGENNN, ENGENDRAR). QUE PRODUCE

COLOR. EJEMPLO:BACTERIACROMGENA.
NOMBRE DADO A CIERTAS SUSTANCIAS INCOLORAS PORSMISMAS, PERO
CAPACES, BAJO DIVERSAS INFLUENCIAS (OXIDACIN) DE ORIGINAR
PRODUCTOS COLOREADOS. EJEMPLO: CROMGENODE LAUROBILINA.

 DETECCIN

CROMOGNICA UTILIZA ENZIMAS QUE CONVIERTEN SUSTRATOS

SOLUBLES EN INSOLUBLES
EL PRODUCTO DE ESTAS ENZIMAS CROMOGNICAS GENERALMENTE EST
UNIDO A ANTICUERPOS SECUNDARIOS
TAMBIN SE PUEDEN UNIR A ANTICUERPOS PRIMARIOS PARA DETECCIN
DIRECTA

ENZIMAS MS COMNMENTE UTILIZADAS

PEROXIDASA DE RABANITO PICANTE (HORSE RADISH PEROXIDASE)

CONVIERTE DAB EN PRODUCTO DE COLOR MARRN

FOSFATASA ALCALINA (ALKALINE PHOSPATASE)

CONVIERTE 3-AMINO-9- ETILCARBAZOL (AEC) EN UN PRODUCTO DE COLOR ROJO.

 CROMGENOS

/ SUSTRATOS Y POTENCIADORES DE LOCALIZACIN

AUMENTAN LA INTENSIDAD DE LA TINCIN DE MUESTRAS DE TEJIDOS
TEIDOS EN LOS MTODOS HISTOQUMICOS.

ENZIMAS MS UTILIZADAS:

PEROXIDASA DE RBANO PICANTE (HRP) Y FOSFATASA ALCALINA (AP)

PARA

SE UTILIZAN JUNTO CON CROMGENO / SUSTRATO APROPIADO

GENERA PRODUCTO DE REACCIN VISUALIZABLE CON MICROSCOPA DE LUZ.

LA DETECCIN HISTOQUMICA USANDO ANTICUERPOS

PRIMARIOS O SECUNDARIOS CONJUGADOS DE ORO EN LA
MICROSCOPA ELECTRNICA, LOS REACTIVOS DE POTENCIADOR DE
PLATA SE PUEDEN UTILIZAR PARA AYUDAR A LA VISUALIZACIN DE
ANTICUERPO UNIDO.

DETECCIN CROMOGNICA
FLUORESCENTE.

A DIFERENCIA DE LOS FLUORFOROS, LOS PRECIPITADOS DE COLOR SON FOTOESTABLES,

GENERALMENTE

ES

MS

SENSIBLE

QUE

DETECCIN

PERMITE EL ALMACENAMIENTO DE LOS PORTAOBJETOS DURANTE MUCHOS AOS.

MIENTRAS LA DETECCIN FLUORESCENTE REQUIERE FUENTES DE LUZ ESPECIALIZADAS Y

FILTROS, LA DETECCIN CROMOGNICA SLO REQUIERE UN MICROSCOPIO ESTNDAR.

SIN EMBARGO, EL PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ES MS LARGO

INCLUYE MS DE UNA ETAPA Y TIEMPOS DE INCUBACIN Y ETAPAS DE BLOQUEO QUE
MTODOS FLUORESCENTES.

CUATRO MTODOS PRINCIPALES DE DETECCIN

AMPLIAMENTE UTILIZADOS EN LA ACTUALIDAD.

CROMOGNICO

INDIRECTO

SON

3-AMINO-9-ETILCARBAZOL(AEC)

4-CLORO-1-NAFTOL

REACTIVO DE HANKER-YATES

NBT

BCIP/NBT
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue
tetrazolium Alkaline Phosphatase)

NEW FUCHSIN

REACTIVO
DE
REVELADO
(CROMGENO/SUSTRATO)
ES
EL
COMPONENTE QUE MS PROBLEMAS PUEDE
GENERAR
EN
UN
PROCEDIMIENTO
INMUNOHISTOQUMICO

CONTROLAR ESTADO DE STE PROBANDO EN

UN TUBO DE ENSAYO CON UNAS GOTAS DE
SISTEMA DE DETECCIN ENZIMTICA A LAS
QUE
AADIMOS
UNAS
GOTAS
DE
CROMGENO

SI EST EN BUEN ESTADO, HABR

CAMBIO GRADUAL DE COLORACIN

UN