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REACCIN EN CADENA DE LA

POLIMERASA (PCR) A TIEMPO REAL


DOCENTE: Mg. Clever Arias Caycho
INTEGRANTES:

Chacn Carbajal Maria


Condori Chahua Roxana

La PCR a tiempo real


La PCR a tiempo real combinada con nuevos
sistemas automticos para la purificacin de
cidos nucleicos, ofrece una plataforma ideal para
el desarrollo de una gran variedad de pruebas
moleculares para la identificacin y cuantificacin
de los agentes infecciosos de inters clnico.

Resea histrica:
En 1983: Reaccin de Cadena de la Polimerasa
(PCR), tcnica desarrollada por Kary Mullis.
PCR: Polymerase Chain Reaction
En 1985: Primera Publicacin de PCR por Cetus
Corporation aparece en Science.
En 1985: Cetus se asoci con Perkin-Elmer e
introdujo el termociclador.
En 1986: Cientficos de Cetus Corporation aislaron
la polimerasa Taq de Thermus aquaticus.

Resea histrica:
En 1989: Science declara a la polimerasa Taq
como Molcula del Ao
En 1991: Hoffmann-La Roche Inc. adquiere
derechos y patentes mundiales de la PCR.
Entre 1992-1993: Higuchi y cols. realizaron la
primera reaccin de PCR en Tiempo Real utilizando
(BrEt) como marcador fluorescente.
En 1993: Premio Nobel de Qumica para Kary
Mullis por su trabajo en PCR.
En 1997: Surgen primeros equipos comerciales
PCR en Tiempo Real, producido por Applied
Biosystems.

Dr. Russ

Qu es la PCR?
Es una reaccin enzimtica in vitro que amplifica millones de veces una
secuencia especfica de ADN durante varios ciclo repetidos en los que la
secuencia blanco es copiada fielmente.
La reaccin aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene
capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las clulas.

Etapas de la PCR
Cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales:
1. Desnaturalizacin: 95C
DNA se denatura, se separan las dos cadenas por
ruptura de enlaces de hidrgeno.
2. Alineamiento o Hibridacin: 55C ~ 70C
Hibridacin de primers, se baja la temperatura y se
facilita unin de primers a las cadenas.
3. Extensin o Elongacin: 72C
ADN polimerasa, inserta diferentes nucletidos
complementarios en el orden que le indica la cadena
molde.

Qu es la PCR a tiempo real?


La PCR a tiempo real o PCR cuantitativa (q-PCR) es una variante
de la reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR) que se utiliza para
amplificar y cuantificar de forma absoluta el producto de la
amplificacin de ADN.

La PCR a tiempo real


Los procesos de amplificacin y deteccin se producen de manera simultnea en el
mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna accin posterior.
Adems, mediante deteccin por fluorescencia se puede medir durante la amplificacin
la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisin de fluorescencia
producida en la reaccin es proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite
conocer y registrar en todo momento la cintica de la reaccin de amplificacin.

La PCR a tiempo real


Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de
fluorescencia y estn diseados para poder medir, en cualquier momento, la
fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificacin.
Los sistemas de deteccin por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real
pueden ser de dos tipos:
Agentes Intercalantes
Sondas especficas marcadas con fluorocromos

La PCR a tiempo real


Agentes Intercalantes:
Son fluorocromos que aumentan notablemente la emisin
de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hlice. El
ms empleado en PCR a tiempo real es el SYBR Green I .
El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un
aumento proporcional de la fluorescencia emitida.
Este Sistema de deteccin tiene la ventaja de que la
optimizacin de las condiciones de la reaccin es muy fcil
y adems, es ms barato que las sondas especficas.

La PCR a tiempo real


Sondas de hibridacin especficas:
Son sondas marcadas con dos tipos de
fluorocromos, un donador y un aceptor.
El proceso se basa en la transferencia de
energa fluorescente mediante resonancia
(FRET) entre las dos molculas.
Las ms utilizadas son:
1. Las sondas de hidrlisis (sondas TaqMan)
2. Las sondas molecular beacons
3. Las sondas FRET

La PCR a tiempo real


1. Las sondas de hidrlisis: (sondas TaqMan)
Son oligonucletidos marcados con un fluorocromo
donador (reporter) en el extremo 5 que emite
fluorescencia al ser excitado y un aceptor (quencher)
en el extremo 3 que absorbe la fluorescencia liberada
por el donador.
A: Sonda est intacta, la fluorescencia emitida por el
donador es absorbida por aceptor.
B: Se produce liberacin de fluorocromo donador por
desplazamiento de Taq polimerasa.
C: Donador y aceptor estn espacialmente alejados,
fluorescencia emitida por donador es captada por el
lector.

La PCR a tiempo real


2. Molecular beacons:
Son sondas parecidas a las anteriores.
Tienen una molcula donadora en el extremo 5 y
una aceptora en el extremo 3 y presentan una
estructura secundaria en forma de asa, en la que
reside la secuencia de unin especfica con el ADN
diana.
En esta conformacin la fluorescencia emitida por el
donador es absorbida por el aceptor y no es captada
por el lector del equipo.

La PCR a tiempo real


3. Sondas FRET:
El sistema se compone de dos sondas que se unen
a secuencias adyacentes del ADN diana.
Una de las sondas lleva un donador en el extremo
3 y la otra un aceptor en el extremo 5.
Cuando las sondas estn hibridadas, los dos
fluorocromos estn prximos. Al ser excitado, el
donador transfiere su energa al aceptor que, a su
vez, emite la fluorescencia que detecta el lector del
equipo.

Principales molculas fluorescentes


empleadas como marcadores en la PCR
a tiempo real

SYBR-Green I:
Fluorocromo

PCR Convencional vs. PCR a Tiempo Real


PCR CONVENCIONAL

PCR A TIEMPO REAL

Deteccin en la Fase Final.

Deteccin en Tiempo Real.

Utiliza el Gel de Agarosa.

Utiliza fluorocromos.

Procesamiento Post-PCR.

Anlisis y cuantificacin en fase


exponencial.

Resultado cualitativo.
Menor precisin y sensibilidad.

Resultado cuantitativo.
Mayor precisin y sensibilidad.

Equipos para PCR a tiempo real


ABI PRISM 7000 Sequence Detection.

Applied Biosystems
Roche Diagnostics

Equipos para PCR a tiempo real

Equipos para PCR a tiempo real

Instrumento

Fabricante

Sistema
trmico

Tiempo de
reaccin

Capacidad

Serie Gene
Amp
Serie AbiPrisn

Aplled
Biosystems

Convencional

2h

96

Lcyler IQ

BioRaf

Convencional

2h

96-384

LightCyler

Roche
Diagnostics

Aire

20-60min

32

SmartCycler

Cephelp

Placa
ceramica

40-60min

16-96

MX400

stratagene

Convencional

90min

96

Rotor Gene

Cobett
Research

Aire

50min

32

Opciones de los equipos de PCR a tiempo


real

Amplificacin y deteccin de DNA o ARN diana en la muestra.


PCR mltiple
Cuantificacin del DNA o ARN diana en la muestra .
Anlisis de curvas de disociacin

Ventajas

Su rapidez
Automatizacin y disminucin del tiempo de anlisis
No hay contaminacin (sistemas cerrados )
Ciclos de amplificacin rpidos
Determinacin de mutaciones puntuales (medicamentos
antimicrobianos)

Desventajas

Requiere equipamiento y reactivos muy costosos.


Debido a su alta sensibilidad, se necesita un correcto diseo
experimental y tcnicas de normalizacin para obtener resultados
precisos.

APLICACIONES DIAGNOSTICO CLINICO


Deteccin /Cuantificacin / Genotipificacin de patgenos:
Virales

(carga viral, carga pro-viral)


Bacterianos
Protozoarios
Hongos
Diagnstico temprano (pacientes asintomticos)
Deteccin de genes de resistencia mejor eleccin de terapia
Monitoreo de terapia (enfermedad residual - recada)
Deteccin de marcadores tumorales
Estado del desarrollo / progresin de la enfermedad

Aplicaciones de la PCR a tiempo real


en la microbiologa
o

Diagnstico de la Sepsis Neonatal


LightCycler SeptiFast Test MGRADE
- Resultado en 6 horas
- 1.5 ml de sangre
- Sin incubacin previa

Conclusiones

La baja probabilidad de contaminacin, la exactitud de los


resultados y la sencillez, rapidez y automatizacin del mtodo,
hacen de la PCRrt una tcnica cada vez ms utilizada en todos los
laboratorios.

GRACIAS
POR SU
ATENCIN