CROMATOGRAFA LQUIDA

DE ALTA PRESIN: HPLC

Msc Holger Maldonado Garca
Bach. Carmen Boschi R.

Cromatografa Lquida de Alta Performance

HPLC
( Modos de Trabajo en HPLC)

Modos de trabajo en
HPLC

FASE NORMAL
Que pasa en el
modo Fase
Normal?

Debido a que la Fase

estacionaria es netamente
Polar, esta retendr ms
fuertemente
a
aquellos
compuestos del tipo polar
(tendrn mayor tiempo de
retencin), que a los no
polares. Esto se debe a que
existen interacciones tipo
Puente de Hidrgeno
entre la fase estacionaria y
la parte polar.

FASE
NORMAL
Como ocurre
esta interaccin?

Cuando dos solutos de marcada polaridad se encuentran en

la corriente de un solvente no polar y una fase estacionaria
polar, la concentracin del soluto polar en el solvente
decrece debido a la interaccin de enlaces tipo Puente de
Hidrgeno.

OH OH
OH

Puente de Hidrgeno

OH CH3 OH
OH
CHOH
CH3
CHCH
CH
3
3 3 CH
3 CH
3 3 CH3 CH3CHCH
3
3 CH3
OH CH3 OH
CH3
CH
3

O
Si

Si

Silica Gel

FASE NORMAL

El Enlace tipo Puente de Hidrgeno

El Tiempo de Retencin y el Enlace tipo Puente de

H O
Hidrgeno
Si
O
H

Si

OH

CH3

HO

H3C
O

CH3

Enlace Puente
de Hidrgeno
Fuerte

t0

CH3

t1

CH3

H3 C

Si

CH3

t2

Si
H

Enlace Puente
de Hidrgeno
Debil

t (min)

FASE NORMAL

El efecto de la Polaridad del Solvente

0%

% Metanol:

2%

5%

3
2
4
3
4

6
1
2
3
4

10

12

14

Dioctil Ftalato
Dibutil Ftalato
Dietil Ftalato
Dimetil Ftalato

16 (min)

0
2
(min)

Solvente Base: Acetonitrilo

(min)

FASE NORMAL

Ejemplo de fases estacionarias:

Del tipo Silica Gel

Del Tipo Ciano

(Para uso General)

Para uso General

OH

HO
Si

Si

Si

Del tipo Amino

Del tipo Diol

(Para el anlisis de Azucares)

(Para el anlisis de Protenas)

OH
Si

NH2

Si

OH
O

FASE REVERSA

Esta combinacin de trabajo es

la contraparte del modo Fase
Normal y se caracteriza por:

Columna: Propiedades No Polares

Ejemplo: Columnas C10, C18, etc.

Solvente: Propiedades Polares.

Ejemplo:
Agua,
Metanol,
Acetonitrilo o sus combinaciones

C10 = Cadena Lineal (Decano)

C18 = Cadena Lineal de 18 Carbonos

FASE REVERSA
Que pasa en
el modo Fase
Reversa?

Debido a que la Fase

estacionaria
es
netamente No Polar, esta
retendr
ms
fuertemente a aquellos
compuestos del tipo No
Polar
(estos
tendrn
mayor
tiempo
de
retencin ya que sern
ms
fuertemente
atrados), que a los
Polares. Esto se debe a la
interacciones no polares.

FASE REVERSA

Si la muestra presenta:

Cadenas Carbonadas

Grupos Aromticos
H3C

Si la muestra presenta:

Grupos Carboxilo
COOH )

Grupos
NH2 )

Grupos Oxidrilo ( - OH
)

CH
2

La interaccin no polar es
fuerte

Amino

(-

La interaccin no polar es
dbil

FASE REVERSA

El Tiempo de Retencin y la Interaccin no

OH
polar
CH3

HO

CH3

H3 C

H3C

CH3

Interaccin no
polar Debil
CH3

t0

t1

CH3

t2

Interaccin polar
Fuerte

t (min)

FASE REVERSA

El efecto de la Polaridad del Solvente

20 % (Agua)
1

30 % (Agua)

40 % Agua

1
3

2
4

2
4

3
4

2
1
2
3
4

(min)

0
2
(min)

p - Hidroximetilbenzoato
p - Hidroxietilbenzoato
p - Hidroxipropilbenzoato
p - hidroxibutilbenzoato

10

12

14

Solvente Base: Metanol

16 (min)

FASE REVERSA

El efecto de la Fase Estacionaria

C4

CH3

HO

CH3

H3 C

H3C

Interaccin
no polar
Debil

CH3

CH3

HO

CH3

H3 C

H3C

CH3

C8

CH3
CH3

CH3

CH3

CH3

HO

C18

CH3
CH3

H3 C

H3C

CH3

CH3

Interaccin no
polar
Fuerte

Interaccin
no polar
Media

FASE REVERSA

El Efecto de la Fase Estacionaria

1 234

Condiciones Analticas
1

Columna

: Shim-Pack CLC ODS

Fase Movil

: Metanol:Agua (7:3)

Razn de Flujo : 1.o mLmin

Temperatura : 40 oC

2
1
3 4
2

Volumen

: 10 uL

Detector

: UV, 254 nm

Analtos

34

1. Metilbenzoato
2. Etilbenzoato
3. n Propilbenzoato

ODS
(Octadecilsilano)

C8
(Octilsilano)

TMS
(Terfenilsilano)

4. n - Butilbenzoato

FASE REVERSA

Ejemplo de fases estacionarias:

Butil Silano

Octil Silano

Octadecilsilano

Del Tipo Fenil

Del Tipo Ciano

Del Tipo TMS

FASE NORMAL vs FASE REVERSA

Caractersticas:
Parmetro

FASE NORMAL

FASE REVERSA

Polaridad de la
columna

Alta polaridad

Baja polaridad

Polaridad del solvente

Baja polaridad

Alta polaridad

Secuencia de Elucin

No polares primero

Polares primero

Incremento Polaridad

Elucin rpida

Elucin lenta

FASE NORMAL vs FASE REVERSA

Fase Normal:

Se obtiene una buena separacin

Estereo Ismeros (Vitamina E, etc.)

Puede cambiarse el tiempo de retencin.

para

Fase Reversa:

Tiempos de retencin con alta repetibilidad.

Fases estacionarias duraderas y resistentes.